慢性冷应激诱导猪多代谢活性组织转录组重塑的分子机制研究

《Communications Biology》：Chronic cold stress induced transcriptomic alterations in multi-metabolically active tissues of pigs

本研究针对猪等家畜生产中冷应激影响生产性能的难题，通过开展慢性冷应激下猪多代谢活性组织转录组与骨骼肌单细胞分辨率代谢重塑研究，揭示了骨骼肌（尤以背最长肌为著）通过激活葡萄糖代谢和氧化磷酸化通路优先分配能量用于产热，并发现氧化代谢成纤维细胞新亚群及其调控网络（CREB3L1、EGR1等转录因子及CXCL通路），阐明了能量摄入增加可增强骨骼肌葡萄糖摄取却抑制生长（IGF通路）、脂肪储存及免疫应答的代谢优先策略，为哺乳动物冷适应机制提供了重要理论依据。

　　

在畜牧业生产中，环境温度波动是影响动物健康和生产性能的关键因素。其中，冷应激尤其对猪只构成了严峻挑战。由于进化历史上缺乏解偶联蛋白1（UCP1）和功能性棕色脂肪组织，猪对寒冷环境格外敏感。冷应激不仅会导致猪只发病率上升、死亡率增加、肉品质下降，造成巨大的经济损失，更会引发一系列复杂的生理反应。动物机体需要通过协调神经系统、内分泌系统和代谢组织（如脂肪、肝脏和骨骼肌）来维持体温稳定，这个过程涉及到全身性的能量重新分配。然而，长期以来，科学界对猪在慢性冷应激条件下，不同代谢组织如何在不同细胞层面上协同响应，以及能量分配的具体策略如何，仍缺乏系统而深入的认识。

为了解决这些科学问题，四川农业大学黄博、白雨蕊、周迅等研究人员在《Communications Biology》上发表了他们的最新研究成果。他们通过为期30天的饲养实验，结合批量转录组测序（bulk RNA-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq）技术，系统描绘了猪在慢性冷应激下多个代谢活性组织（特别是骨骼肌）的转录组图谱和细胞代谢重塑特征，揭示了能量分配优先支持产热而非生长的代谢策略。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，他们设计了室温（RT）、慢性冷应激（CS）和配对饲喂（PF）三组实验，使用19头雄性巴马小猪进行了30天的可控饲养试验。其次，他们采集了背最长肌（LDM）、腓肠肌（GAS）、肝脏、内脏脂肪（GOM）和皮下脂肪（ULB）这五种代谢相关组织，进行了批量RNA测序。接着，他们特别针对背最长肌样本，进行了高精度的单核RNA测序，捕获了49,508个细胞核进行分析。在数据分析方面，他们运用了差异表达分析、基因集富集分析（GSEA）、细胞亚群比例分析、代谢活性评分（scMetabolism）、细胞轨迹推断（Monocle 3）、转录调控网络分析（SCENIC）以及细胞间通讯分析（CellChat）等多种生物信息学方法。

能量分配在冷应激猪中优先考虑产热而非生长

为了探究慢性冷暴露对猪能量分配的影响，研究人员进行了为期30天的对照饲养试验。结果表明，尽管冷应激组（CS）的每日采食量比室温组（RT）和配对饲喂组（PF）高出约23%，但其最终体重与室温组无显著差异。而配对饲喂组（暴露于冷应激但摄入与室温组相同的饲料）的最终体重显著低于室温组（降低14.83%）。这一发现表明，在慢性冷应激下，猪可能将额外的能量分配给了产热，而不是生长，揭示了在热量产生和生长之间存在能量分配的权衡。

代谢活性组织在慢性冷应激下呈现独特的转录特征

通过对五种代谢活性组织的转录组分析，研究人员发现不同组织对冷应激的转录响应具有明显的组织特异性。其中，背最长肌（LDM）表现出最显著的转录组变化，在CS vs RT（CR）和PF vs RT（PR）比较中分别鉴定出2278和2330个差异表达基因（DEGs），而肝脏的变化最小。基因集富集分析（GSEA）显示，与冷应激相关的激素通路在所有组织中均被激活，而氧化代谢和免疫应答通路则被抑制。值得注意的是，骨骼肌（LDM和GAS）独特地激活了与葡萄糖代谢和自噬相关的通路，而脂肪组织则显示出细胞骨架重塑和脂肪酸代谢通路的富集。这些结果勾勒出冷应激下代谢组织的特异性转录应答图谱，并提示猪骨骼肌，尤其是背最长肌，是响应冷应激的核心组织。

慢性冷应激改变猪骨骼肌细胞组成

为了更精确地表征冷应激下骨骼肌的细胞异质性，研究人员对背最长肌样本进行了单核RNA测序分析。他们共鉴定出19个不同的细胞亚群，包括4种肌核群体（I型、IIA型、IIX型、IIB型）、7种成纤维细胞亚群（如FAPs、氧化代谢型、NRXN1、EPHA3等）以及其他细胞类型（如神经肌肉接头、肌肉干细胞MuSCs、内皮细胞、免疫细胞等）。细胞比例分析显示，与室温组相比，冷应激组（CS）和配对饲喂组（PF）中IIB型肌核和氧化代谢成纤维细胞的比例显著增加，而I型肌核、NRXN1成纤维细胞、EPHA3成纤维细胞、B&T细胞、巨噬细胞和脂肪细胞的比例则下降。这种细胞组成的改变暗示冷应激诱导了骨骼肌细胞景观的重塑。

慢性冷应激下猪骨骼肌细胞代谢活性的定量分析

通过整合批量RNA测序和单核RNA测序数据，研究人员评估了骨骼肌各细胞亚群在六条关键代谢通路中的活性：类固醇激素生物合成、糖酵解/糖异生、脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、氧化磷酸化和三羧酸循环（TCA循环）。结果显示，慢性冷应激显著增强了肌核和成纤维细胞在类固醇激素生物合成、糖酵解/糖异生、脂肪酸降解、氧化磷酸化和TCA循环方面的代谢评分，同时抑制了脂肪酸生物合成。值得注意的是，细胞亚群间存在代谢异质性：IIB型肌核的比例增加，但其葡萄糖代谢评分却降低，表明冷应激诱导产生的新增IIB型肌核代谢活性较低。更重要的是，冷应激诱导形成了氧化代谢成纤维细胞这一特殊亚群，提示其在冷应激代谢响应中可能扮演关键角色。额外的能量摄入（CS组 vs PF组）在一定程度上改变了细胞的代谢活性，例如CS组的葡萄糖代谢活性高于PF组，而氧化磷酸化水平较低，说明能量供应状态影响了细胞层面的代谢策略。

慢性冷应激诱导氧化代谢成纤维细胞的形成

研究人员发现，氧化代谢成纤维细胞亚群高表达氧化磷酸化相关基因（如COX1、COX2、COX3），并富集于线粒体电子呼吸链通路，在七种成纤维细胞中具有最高的氧化磷酸化活性。细胞分化潜能分析（CytoTRACE）表明，该亚群可能处于FAPs（纤维脂肪源性祖细胞）分化的下一阶段。为了阐明其形成的转录调控机制，研究人员应用SCENIC（单细胞调控网络推理）技术，识别出五个关键调控因子（转录因子）：CREB3L1、EGR1、EGR2、BHLHE41和KLF5，它们构成了驱动氧化代谢成纤维细胞形成的核心调控模块（M2模块）。这些调控因子的表达在冷应激组（CS和PF）中显著上调。此外，细胞通讯分析揭示CXCL信号通路在冷应激后被特异性激活，可能参与了该成纤维细胞亚群的重塑。

慢性冷应激重塑猪骨骼肌细胞通讯

通过对背最长肌细胞间信号传递的分析，研究人员发现，与室温组相比，冷应激组（CS和PF）的细胞相互作用数量和强度均显著降低。其中，平滑肌细胞、肌核和成纤维细胞之间的相互作用下降尤为明显。在常见的信号通路中，如VISFATIN、ANGPT和IGF（胰岛素样生长因子）等通路的通讯概率在冷应激下显著降低。值得注意的是，IGF通路是强大的合成代谢信号通路，对肌肉生长至关重要。冷应激抑制了该通路的通讯（主要源自MuSCs和成纤维细胞，靶向肌核、脂肪细胞等），这可能是抑制肌肉生长的机制之一。然而，额外的能量摄入（CS组）部分恢复了IGF通路的通讯概率。另一方面，CXCL通路在冷应激后被特异性激活，其信号主要靶向氧化代谢成纤维细胞和FAPs，可能参与了对成纤维细胞亚群的重塑。

综上所述，这项研究系统地揭示了猪在慢性冷应激下发生的多组织转录重编程和骨骼肌细胞代谢重塑。研究结果表明，慢性冷应激诱导了猪，特别是其骨骼肌（以背最长肌为代表）的显著转录和代谢变化，其中葡萄糖代谢的激活是优先支持产热的关键。在单细胞层面，冷应激驱动了骨骼肌细胞的异质性和能量代谢重塑，其特征是IIB型肌核和氧化代谢成纤维细胞亚群的增加。尤为重要的是，研究揭示了能量分配的策略：在冷应激下，即使增加能量摄入，这些额外的能量也主要用于增强骨骼肌的葡萄糖利用和自噬，而不是分配给生长（通过抑制IGF通路）、免疫应答和脂肪储存。这凸显了在冷诱导产热过程中，膳食能量代谢优先于自身消耗的代谢策略。

这项研究不仅深化了对猪冷适应机制的理解，为改善寒冷环境下猪的饲养管理和抗逆育种提供了重要的理论依据和潜在的分子靶点，其揭示的能量分配优先原则和细胞特异性代谢重塑机制，也为理解哺乳动物应对环境温度胁迫的普遍生理策略提供了新的视角。