G1期CDK4/6、CDK2与ERK协同失活触发终末分化命运决定的机制研究

《Communications Biology》：Inactivation of CDK4/6, CDK2, and ERK in G1-phase triggers differentiation commitment

本研究针对终末分化过程中细胞周期退出与分化承诺如何协同调控这一关键科学问题，通过活细胞成像技术，揭示了在脂肪细胞分化模型中，G1期CDK4/6、CDK2和ERK信号的时序性失活是触发不可逆分化承诺的核心机制。研究发现，细胞密度增加和分化刺激共同导致cyclin D1下降和p27升高，进而抑制CDK活性，延长G1期；随后ERK失活解除对PPARγ的抑制，使其达到分化阈值并诱导p21/p18表达，最终实现永久性细胞周期退出。该研究为理解组织发育和再生中细胞命运决定提供了重要理论依据。

　　

在生命体的发育与维持稳态过程中，干细胞或祖细胞如何停止增殖，并不可逆地转变为具有特定功能的终末分化细胞（如脂肪细胞、肌肉细胞、神经元），是一个基础且至关重要的生物学问题。这个过程一旦出错，例如分化细胞无法永久退出细胞周期，就可能成为癌症的温床。尽管我们知道细胞分化通常伴随着细胞周期的永久退出，并且这两个过程在早期相互抑制，但科学家们对于在分子层面上，细胞是如何精确地“踩下刹车”，结束增殖期，并同时“启动开关”， commitment（承诺）到分化命运的详细机制，仍然知之甚少。特别是，哪些关键的信号分子扮演了“决策者”的角色，它们之间的协作关系又是怎样的？这些问题的答案，对于理解发育生物学、再生医学乃至肿瘤发生都具有深远的意义。

为了深入探究这一细胞命运的终极决策过程，研究人员将目光投向了脂肪细胞分化（adipogenesis）这一经典模型。脂肪细胞分化由关键转录因子PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）主导，其表达水平一旦超过某个临界阈值，就会通过正反馈回路锁定在高水平，驱使细胞不可逆地走向成熟脂肪细胞。此前的研究表明，细胞只有在细胞周期的G1期才能做出这种分化承诺，但背后的分子调控网络一直是个黑箱。

发表在《Communications Biology》上的这项研究，由Sanjeev Sharma、Henri Berger、Tobias Meyer和Mary N. Teruel等人完成，他们巧妙地利用活细胞成像技术，如同给细胞安装了一个“实时监控系统”，首次在单细胞水平上同步追踪了脂肪祖细胞在分化过程中，其细胞周期核心调控因子（CDK4/6和CDK2）的活性动态与核心分化调控因子（PPARγ）的表达变化。这项研究揭示了一个精妙的时序性调控模型：CDK4/6、CDK2和ERK信号的协同失活，是连接细胞周期退出与分化承诺的关键桥梁。

研究人员为开展此项研究，主要应用了几项关键技术：利用CRISPR基因编辑技术构建了内源性PPARγ标记（mCitrine-PPARG）的细胞系；引入了荧光激酶易位报告系统（KTR），用于实时、动态、无创地监测CDK4/6和CDK2的激酶活性；结合荧光泛素化细胞周期指示器（FUCCI）报告系统，精确界定细胞周期各时相；采用了镶嵌共培养和活细胞长时间追踪成像技术，以克服高细胞密度下追踪单细胞的难题；并辅以小分子抑制剂（如Palbociclib、Tagtociclib）、siRNA基因敲降、免疫荧光染色和蛋白质印迹（Western Blot）等分子生物学手段进行功能验证。

研究结果

要么CDK4/6要么CDK2必须在G1期激活以驱动脂肪祖细胞增殖

研究人员首先在未受刺激的OP9脂肪祖细胞中发现，CDK4/6和CDK2的活性在细胞周期中高度协同：它们在每次有丝分裂后一同下降，然后又一同升高启动新的细胞周期，或者一同保持低活性状态。使用特异性抑制剂分别抑制CDK4/6或CDK2后，令人惊讶的是，大部分细胞仍能通过激活另一条通路（例如，CDK4/6抑制下CDK2仍可激活；CDK2抑制下，CDK4/6可能通过激活CDK1）延迟进入S期。只有当CDK4/6和CDK2被同时抑制时，细胞增殖才被完全阻断。这表明在脂肪祖细胞中，CDK4/6和CDK2在驱动G1期进程上存在冗余性，只要其中之一活跃，细胞就能增殖；而只有当两者均被失活时，细胞才能退出细胞周期。

祖细胞在终末分化期间通过G1期失活CDK4/6和CDK2永久退出细胞周期

当加入脂肪分化诱导剂（DMI）后，细胞会先进行可变次数的分裂。在每次分裂后的G1期，CDK4/6和CDK2的活性同样面临选择：要么被重新激活进行下一轮分裂，要么被持续抑制。动力学分析显示，CDK4/6的激活通常略早于CDK2。同样，在分化条件下，单独抑制CDK4/6或CDK2只能延迟而非完全阻止细胞进入S期，只有同时抑制两者才能有效终止分化早期的增殖期。这证实了无论是在基础增殖还是分化诱导的增殖过程中，CDK4/6和CDK2的双重失活都是细胞周期退出的必要条件。

PPARγ诱导要求CDK4/6和CDK2在G1期失活

关键问题在于，CDK活性如何与分化承诺点关联？实时追踪显示，在最终分化的细胞中，CDK4/6和CDK2的活性在分化诱导后约18-36小时发生持续性下降，这个时间点与PPARγ水平达到分化承诺阈值的时间大致吻合。绝大多数细胞都是在CDK2活性失活之后，PPARγ水平才开始上升，且两者之间存在数小时至数天的可变延迟。更重要的是，当研究人员通过siRNA敲降p21和Rb来人为维持高CDK活性时，细胞持续增殖，分化承诺被显著抑制和延迟，只有那些CDK活性最终下降的细胞才能分化。这证明活化的CDK4/6和CDK2会抑制PPARγ的积累，它们的失活是PPARγ得以增加并触发分化承诺的前提。

PPARγ诱导的p21和p18巩固了cyclin D1和p27调控的CDK失活

那么，是什么导致了CDK活性的初始下降？研究人员检测了G1期关键调控蛋白的水平。他们发现，在PPARγ水平升高之前，核内cyclin D1水平已经开始逐渐下降，而CDK抑制蛋白p27的核水平则逐渐升高，这种变化在无论最终是否分化的细胞中均存在，说明其不依赖于PPARγ。这种cyclin D1减少和p27增加的趋势，与细胞在分化过程中因增殖导致局部密度增加密切相关。高细胞密度可独立诱导cyclin D1下降和p27升高，从而解释了下调CDK活性的初始动力。相比之下，p21和p18的水平仅在PPARγ达到承诺阈值并升高后才显著增加。这表明，分化早期的可逆性细胞周期停滞（G1期延长）主要由细胞密度介导的cyclin D1/p27变化驱动，为PPARγ积累赢得了时间；而一旦PPARγ超过阈值，它诱导的p21和p18则负责强化并永久维持CDK的失活状态，实现不可逆的细胞周期退出。

延迟的细胞密度和DMI介导的ERK失活也是PPARγ增加所必需的

一个意想不到的发现是，仅仅失活CDK4/6和CDK2并不足以有效触发分化承诺。研究人员推测并验证了ERK信号的关键作用。他们发现，在分化过程中，ERK的磷酸化水平随着时间推移和细胞密度增加而逐渐下降。这种失活一方面由增殖导致的细胞密度增加引起，另一方面也受分化刺激（如DMI中的地塞米松可能诱导ERK磷酸酶DUSP1表达）的调控。功能实验表明，在分化早期后抑制MEK/ERK活性，能显著促进PPARγ升高和分化承诺；反之，通过诱导表达持续激活的MEK（CA-MEK）来维持ERK活性，则会强烈抑制分化，即使同时抑制了CDK4/6和CDK2，分化仍被显著延迟。这表明ERK失活对于分化承诺不仅是必要的，而且其作用部分独立于CDK通路，可能通过直接磷酸化PPARγ并抑制其转录活性来实现。

CDK4/6-CDK2和ERK的顺序失活将可逆增殖期与分化承诺分离开来

最后，研究人员比较了不同干预措施的急性效应。他们发现，在分化诱导后抑制MEK能迅速（24小时内）提升PPARγ水平，而抑制CDK则效果较慢，两者联合抑制效果最佳。这表明，对于许多已经处于CDK低活性状态的细胞而言，ERK的失活是触发PPARγ快速积累和分化承诺的限速步骤。ERK活性如同压在PPARγ表达上的最后一道“枷锁”，只有解除它，分化程序才能全力启动。

结论与意义

这项研究成功地描绘了脂肪细胞终末分化过程中，细胞周期退出与分化承诺协同调控的精细时空图谱。它揭示了一个核心范式：祖细胞在分化信号刺激下，首先利用CDK4/6和CDK2的冗余活性进行有限次数的增殖扩张；随后，由细胞密度增加和分化信号共同作用，通过降低cyclin D1和升高p27来初始抑制CDK活性，导致G1期延长，为分化决策创造时间窗口；在此窗口期内，ERK信号的失活成为触发PPARγ突破临界阈值的最终“扳机”，而高水平的PPARγ又通过诱导p21和p18来永久锁定CDK的失活状态，从而完成从增殖到终末分化的不可逆转变。

该研究的突破性意义在于：首先，它明确了CDK4/6和CDK2在终末分化早期增殖阶段的冗余功能，以及二者必须同时失活才能退出周期的关键原则。其次，它发现了ERK失活在分化承诺中不可或缺的直接作用，澄清了以往关于ERK在脂肪生成中看似矛盾的报告，指出其具有时间依赖性双重角色（早期促增殖，晚期抑分化）。最后，它构建了一个将外部信号（分化诱导剂）、物理微环境（细胞密度）与内部核心调控网络（CDK、ERK、PPARγ、细胞周期抑制剂）整合在一起的动态模型。

这一模型很可能具有普适性，对于理解其他类型细胞（如肌细胞、神经元）的终末分化机制提供了重要借鉴。在应用层面，该研究阐明的关键节点（CDK4/6、CDK2、ERK）为干预脂肪生成异常相关疾病（如肥胖、代谢综合征、某些癌症）提供了新的潜在靶点。通过调控这些节点的活性，或许未来能够精确控制组织再生或抑制异常细胞增殖，具有广阔的转化医学前景。