将理性设计与机器学习相结合，开发一种新型塑料解聚酶，用于分解基于PBAT的覆盖膜，以实现可持续回收

《Journal of Hazardous Materials》：Integrating rational design and machine learning to engineer a novel plastic depolymerase to break down PBAT-based mulch film for sustainable recycling

本研究通过结构分析和机器学习优化了PBAT降解酶Thermobifida halotolerans来源的PET hydrolase，开发出DCTPC_4M_S122H突变体，其熔点提升33.9°C，在37-70°C范围内显著提高PBAT降解效率，可在20小时内完全降解薄膜，并产纯度≥99%的精制对苯二甲酸。

　　PBAT，即聚己二酸三亚甲基酯（Polybutylene adipate terephthalate），是一种被广泛认为是传统聚烯烃类塑料的环保替代品的生物降解材料。它在包装、农用地膜以及多种工业应用中得到了广泛使用。然而，尽管PBAT被归类为可生物降解材料，其在自然环境中的降解效率却相对较低，导致了持续的生态污染。因此，开发高效降解PBAT的酶，尤其是具有广泛热适应性的酶，成为解决这一问题的关键挑战。

在本研究中，我们通过共识序列分析，从嗜盐芽孢杆菌（*Thermobifida halotolerans*）中鉴定出一种新的PET水解酶（ThPETase）。随后，我们利用结构和表面电荷引导的设计方法，结合机器学习模型EvolvePro，对该酶进行了工程改造。经过优化后的变体DCTPC_4M_S122H（ThPETase_N48D/D204C/L213T/S214P/D253C/S68K/D105R/G194Q/D232K/S122H）相较于野生型酶，其熔点（T_m）提高了33.9°C，并且在37-70°C的温度范围内表现出更强的对PBAT粉末的水解活性。特别是在37°C时，其PBAT降解效率提高了91倍，显著优于之前报道的酶。

更值得注意的是，该变体能够在37°C下于20小时内高效降解PBAT基的农用地膜，50°C下仅需8小时，60°C下仅需6小时，这一速度远超之前报告的酶。通过酶解过程，可以获得高达99%纯度的对苯二甲酸（terephthalic acid，TPA），这可以被直接回收并用于PET和PBAT的合成，从而实现塑料废弃物的闭环回收系统，为可持续的塑料管理提供了新的可能。

塑料已成为现代文明不可或缺的基础，支撑着技术创新和全球经济的发展。自20世纪以来，全球塑料产量经历了显著的增长，从1950年的约200万吨增加到2022年的4亿吨，这一增长幅度达到了200倍。预计到本世纪中叶，塑料产量可能超过5亿吨。然而，随着产量的增加，环境风险也随之加剧。塑料的固有抗降解性导致了广泛的环境污染，成为全球环境治理面临的重要挑战。PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）作为广泛使用的塑料，其在饮料行业中的应用尤为突出，PET瓶占据了软饮料包装市场的67%。这些废弃物构成了全球固体废弃物的12%，突显了有效处理PET塑料包装废弃物的迫切需求。

相比之下，化学降解塑料会释放大量有毒有害物质，可能造成二次污染，同时消耗大量能源。而生物降解方法则提供了更为温和、环保的途径，为塑料回收开辟了新的可能性。然而，传统塑料的合成时间相对较短，不足以为微生物进化出专门的降解途径提供足够的时间。因此，天然存在的塑料降解酶能够分解合成聚合物的能力，可能源于这些人工材料与微生物自然底物之间的结构相似性。例如，角质酶（cutinase）天然降解角质，这是一种复杂的支链聚酯，其化学结构与某些合成聚酯材料具有相似之处。

在PET降解酶的研究中，叶堆腐生角质酶（LCC）和*Ideonella sakaiensis* PETase（IsPETase）被认为是研究最为深入的候选酶。LCC经过工程改造后，其变体LCC_ICCG能够在10小时内将至少90%的PET分解为单体，每小时产生16.7克/升的TPA。进一步研究LCC_ICCG促使了LCC-ICCG-6M变体的开发，该变体在75°C下对PET粉末的催化效率显著优于野生型LCC_ICCG。Yoshida等人报道了一种从细菌中分离出的两种酶，包括PETase和MHETase，它们能够在30°C下将PET分解为TPA和乙二醇（EG）。值得注意的是，PETase在30°C下的PET降解效率显著高于LCC、TfH和THc_Cut1等之前报道的酶，因此PETase被广泛认为是塑料降解和回收的有前景的酶。

为了提高IsPETase的稳定性，研究人员开发了DuraPETase，该变体通过一种称为GRAPE的计算策略，其熔点提高了31°C，并在中等温度下显著提高了半结晶PET薄膜的降解能力。FastPETase是一种通过基于结构的机器学习方法设计的PET水解酶，表现出优于IsPETase、ThermoPETase、DuraPETase、LCC以及LCC_ICCM的PET水解活性，其活性在30-50°C的温度范围内和多种pH条件下均表现优异。

尽管在PET降解酶的开发方面取得了诸多进展，但工程出高效的PBAT水解酶仍然是一个重大挑战。虽然PBAT地膜可以在堆肥和土壤环境中被微生物降解，但其在土壤中的降解速率相对较慢。更严重的是，PBAT降解过程中产生的微塑料不仅影响植物的生长和发育，还显著改变根际和根区微生物群落的多样性、物种组成和功能特性，可能带来生态风险。目前，能够有效降解PBAT的酶种类有限，且其温度活性范围较窄，如AaCut4/AaCut10的温度活性范围为20-45°C，LCC/LCC_ICCG/TfCut DM/TfCut-DM Q132Y的温度活性范围为60-75°C，这限制了它们在多样工业应用中的适用性。

因此，高效发现和工程PBAT降解酶对于解决这一问题至关重要。传统理性设计策略，如回到共识残基、结构分析、二硫键工程以及表面电荷分布优化，通常依赖于对蛋白质序列、结构和催化机制的详细知识。虽然这些方法可以增强酶的活性或稳定性，但它们在可扩展性和依赖先验知识方面存在局限。近年来，人工智能（AI）驱动的蛋白质工程，特别是基于蛋白质语言模型（PLMs）和机器学习的方法，成为了一种有前景的替代方案。这些模型通过训练大规模的天然蛋白质序列数据集，能够在“零样本”方式下实现蛋白质的计算机模拟进化，无需结构信息或专家知识，通常只需少量序列即可优化蛋白质功能。然而，传统的零样本预测在优化复杂或多目标蛋白质功能方面效果有限，而EvolvePro的开发则推动了这一范式的发展，使其能够在最小的实验筛选下实现高效的序列空间探索。

EvolvePro结合了进化规模建模（ESM）和顶层回归模型，以学习蛋白质适应性景观并指导迭代设计过程。令人印象深刻的是，EvolvePro在零样本方法上表现出显著优势，成功优化了六种不同的蛋白质，包括抗体结合亲和力提高40倍和T7 RNA聚合酶转录保真度提高100倍。因此，将传统理性设计策略与EvolvePro相结合，可能为开发高性能的PBAT降解酶提供更有效和流畅的途径。

在本研究中，我们的目标是开发下一代塑料水解酶，以增强其在广泛温度范围内的稳定性和实用性，从而高效降解PBAT基的农用地膜。为此，我们设计了一个综合的流程，称为“CSM-Evo”（共识、结构和机器学习引导的进化），该流程整合了共识设计、结构洞察和机器学习指导，以实现系统的酶发现和优化。

我们仅选择两种PETase作为模型，以识别塑料降解酶，因为IsPETase和LCC是最具代表性且研究最深入的酶，它们具有丰富的结构、活性和突变数据。这两种酶已被用作多个高性能变体（如FastPETase和LCC-ICCG）的母骨架。为了保持概念清晰并专注于已建立的催化框架，我们使用这两种酶作为模型，以识别和工程PBAT活性的酶。由于PBAT和PET在单体组成上有所不同，但它们在结构和化学特性上具有共性。PET由乙二醇和对苯二甲酸组成，而PBAT则由丁二醇、己二酸和对苯二甲酸组成。这两种聚合物都包含重复的酯键和对苯二甲酸单元。因此，已建立的PET水解酶如IsPETase和LCC为理性设计或筛选PBAT活性酶提供了有价值的结构框架。这一方法利用已建立的催化架构，将底物范围扩展到如PBAT这样的脂肪族-芳香族共聚酯。

基于上述考虑，我们利用两种已建立的PET降解酶IsPETase和LCC，构建了共识序列：Con_IsPETase和Con_LCC。通过BLAST分析和PET粉末活性测定，我们鉴定了三种具有塑料降解活性的酶：AtPETase、StPETase和ThPETase。其中，ThPETase能够同时降解PET粉末和PBAT薄膜，因此我们对该酶进行了工程改造。基于结构比对、共识突变、表面电荷分布优化、蛋白质语言模型和EvolvePro，我们开发出一个变体DCTPC_4M_S122H（ThPETase_N48D/D204C/L213T/S214P/D253C/S68K/D105R/G194Q/D232K/S122H），其熔点（T_m）比野生型提高了33.9°C，并且在37-70°C的温度范围内表现出对PBAT粉末的极强水解活性。在37°C条件下，该变体可在20小时内高效降解PBAT基的农用地膜，50°C下仅需8小时，60°C下仅需6小时，其降解效率在37-60°C范围内均优于之前报道的酶。此外，该变体还能在37°C下将PBAT基的农用地膜降解为粉末，生成高达99%纯度的TPA。

这一成果不仅为PBAT的高效降解提供了新的可能，也为实现塑料废弃物的闭环回收系统奠定了基础。通过开发具有高热稳定性和广温活性的PBAT水解酶，我们能够将降解过程中的副产物直接回收并用于新塑料的合成，从而减少对环境的污染，提高资源的利用率。此外，这一研究还展示了人工智能在蛋白质工程中的巨大潜力，为未来开发更多高效降解酶提供了方法论上的支持。通过结合传统理性设计和AI驱动的优化策略，我们有望在更短的时间内开发出更多具有实用价值的生物催化剂，为解决塑料污染问题提供更加系统和高效的技术路径。

在实际应用中，PBAT因其良好的生物相容性、柔韧性和加工性能，被广泛用于高分子包装薄膜的生产。这种材料不仅在包装行业中有广泛应用，还被用于农业薄膜和一次性餐具等领域。然而，PBAT在自然环境中的降解效率较低，导致其在土壤中的降解过程缓慢，且在海洋环境中几乎无法降解，从而造成持续的环境污染。因此，开发能够高效降解PBAT的酶，不仅有助于减少环境污染，还能推动塑料资源的循环利用，为可持续发展提供支持。

本研究中开发的DCTPC_4M_S122H变体，通过CSM-Evo策略，成功实现了对PBAT的高效降解。这一变体在多种温度条件下均表现出优异的催化活性，特别是在37°C时，其降解效率显著提升。此外，该变体的高热稳定性使其能够在更广泛的温度范围内发挥作用，这为实际应用提供了更大的灵活性。通过该酶的使用，我们可以将PBAT降解过程中产生的TPA直接回收，用于PET和PBAT的合成，从而构建一个闭环的塑料回收系统。这种系统不仅减少了对环境的污染，还提高了资源的再利用率，为实现塑料废弃物的可持续管理提供了新的解决方案。

此外，该研究还展示了人工智能在蛋白质工程中的强大能力。通过EvolvePro等机器学习模型，我们能够高效探索蛋白质序列空间，从而在更短的时间内找到具有特定功能的变体。这种方法不仅提高了开发效率，还减少了实验筛选的次数，降低了研发成本。通过结合传统理性设计和AI驱动的优化策略，我们有望在未来开发出更多具有实用价值的生物催化剂，为解决塑料污染问题提供更加系统和高效的技术路径。

总之，本研究通过CSM-Evo策略，成功开发出一种高效的PBAT降解酶，为塑料废弃物的可持续管理提供了新的可能。这一成果不仅展示了人工智能在蛋白质工程中的应用前景，还为未来开发更多高效降解酶提供了方法论上的支持。通过结合传统理性设计和AI驱动的优化策略，我们有望在更短的时间内找到更多具有实用价值的生物催化剂，为解决塑料污染问题提供更加系统和高效的技术路径。这一研究的成果对于推动环保材料的广泛应用和塑料废弃物的闭环回收系统具有重要意义。