端粒RNA（TERRA）与HP1a形成界面簇稳定异染色质凝聚相

《Communications Biology》：Telomeric RNA and HP1α form interfacial clusters that stabilize HP1α-DNA condensates

本研究针对异染色质蛋白HP1a与核酸相分离的调控机制尚不明确的问题，开展了关于端粒重复序列RNA（TERRA）如何调节HP1a-DNA凝聚相的主题研究。研究发现，TERRA与HP1a能形成不混溶的多相凝聚体，其中TERRA富集相位于HP1a-DNA凝聚相界面，这种界面簇能稳定DNA凝聚相并调节其融合动力学。该工作揭示了非编码RNA通过调控相分离界面性质来影响异染色质组织的新机制，对理解端粒稳态维持及相关疾病具有重要意义。

　　

在真核细胞的细胞核内，染色质的高度有序组织对基因调控至关重要。其中，异染色质作为一种浓缩的染色质形式，在基因沉默和端粒等重复序列区域的稳定性维持中扮演关键角色。异染色质蛋白1a（HP1a）是构成性异染色质的重要组分，其与DNA的相分离被认为是驱动异染色质域形成的重要机制。然而，调控HP1a相分离和凝聚相稳定性的精细分子机制，尤其是非编码RNA在其中可能发挥的作用，仍不甚清晰。端粒作为染色体末端的特殊结构，其稳定性对基因组完整性至关重要。有趣的是，端粒区域富含异染色质组分，同时又能转录产生一种名为端粒重复序列RNA（TERRA）的长链非编码RNA。TERRA被认为在端粒异染色质的形成和维持中起作用，但其具体的生物物理机制，特别是它如何与HP1a和DNA相互作用来影响异染色质的组织和动力学，是一个亟待解答的科学问题。

为了深入探究TERRA在HP1a介导的相分离中的作用，由Priyasha Deshpande、Anna Geissmann、Hye-Jin Park、Jia Liu、Patrizia Casaccia和Shana Elbaum-Garfinkle等人组成的研究团队在《Communications Biology》上发表了他们的最新研究成果。他们利用体外重构系统，结合先进的成像和生物物理技术，揭示了TERRA通过其独特的序列和结构，与HP1a形成界面簇，从而稳定HP1a-DNA凝聚相并调节其物理性质的新机制。

研究人员主要运用了体外相分离重构、共聚焦显微镜成像、荧光漂白恢复（FRAP）技术、三维结构重建、核磁共振（NMR）波谱分析以及细胞水平的RNA原位杂交（RNAScope）结合免疫荧光等技术。研究使用了重组表达的HP1a蛋白、不同长度的双链DNA以及一系列具有特定序列和结构的RNA（包括TERRA及其突变体、其他G-四链体RNA等）。细胞实验使用了小鼠小胶质BV2细胞系。

HP1a在DNA和端粒重复序列RNA存在下形成多相凝聚体

研究人员首先在体外重构了HP1a与DNA或TERRA RNA的相分离系统。他们发现，HP1a与DNA形成大的球形凝聚体，而与TERRA45 RNA则形成更小的簇状结构。当HP1a、DNA和TERRA45三者共存时，系统形成了多相凝聚体。共聚焦显微镜三维成像显示，富含TERRA45和HP1a的较小相（1-3微米）特异性地定位在更大的HP1a-DNA凝聚相的界面处。这种多相结构的形成不依赖于各组分的添加顺序，并且在生理浓度的HP1a（10微摩尔）下，TERRA与DNA的比例可以调节系统的相态组织。

TERRA RNA与HP1a之间的序列特异性相互作用驱动不混溶性

为了探究多相形成的决定因素，研究团队测试了多种RNA序列。结果证实，多相形成具有高度的序列特异性。只有具有完整端粒重复序列的TERRA（如TERRA45和TERRA96）能够驱动多相形成，而长度较短的TERRA22、序列打乱的shuff-TERRA45、非结构化的同聚物（如polyU50）以及其他能形成G-四链体（G4）结构的RNA（如FMR1, Map1b, Sc1-double）均不能形成类似的多相结构。核磁共振分析显示，虽然部分RNA能形成G4结构，但仅有TERRA能诱导多相分离。更重要的是，将HP1a铰链区中与TERRA结合相关的三个赖氨酸残基突变为丙氨酸（HP1a-3K-A突变体）后，该突变体虽然仍能与DNA发生相分离，但却失去了在TERRA存在下形成不混溶相的能力。这表明TERRA与HP1a之间特定的分子识别，而非单纯的G4结构或静电相互作用，是多相结构形成的关键。

TERRA45-HP1a相互作用导致形成动力学降低的稳定凝聚体

研究人员进一步比较了HP1a与TERRA45或其突变体（mut-TERRA45）形成的二元凝聚体的性质。虽然两者都能形成凝聚体，但荧光漂白恢复实验表明，HP1a在TERRA45凝聚体中的流动性显著低于在mut-TERRA45凝聚体中，其半恢复时间更长，可动分数更低。这表明TERRA45与HP1a的相互作用形成了更刚性、更稳定的网络。与此一致，在高盐（5M NaCl）处理下，多相系统中的HP1a-DNA核心相迅速溶解，而界面的TERRA45-HP1a簇却保持完整，进一步证明了其超常的稳定性。

TERRA45 RNA簇稳定HP1a-DNA凝聚体

鉴于TERRA富集相位于界面且性质稳定，研究人员探讨了它们对HP1a-DNA凝聚体物理性质的影响。接触角测量显示，随着TERRA45浓度的增加，HP1a-DNA凝聚体在玻璃表面的接触角显著增大，表明其润湿性降低，界面性质发生了改变。这种效应是TERRA45特异性的，因为mut-TERRA45或TERRA22均不能引起类似变化。虽然界面性质被改变，但HP1a在DNA核心相内部的动力学并未受到TERRA界面簇的显著影响。时间序列成像分析发现，TERRA富集的界面相在凝聚体接触时构成了物理屏障，阻碍了凝聚体之间的融合，从而减少了凝聚体的粗化过程。这一定量表现为随着TERRA45浓度的增加，体系的平均凝聚体尺寸显著减小，而mut-TERRA45则无此效应。

本研究揭示了一种由非编码RNA序列特异性驱动的新型生物分子凝聚体组织模式。TERRA通过其独特的序列与HP1a发生特异性相互作用，形成稳定的、不混溶的界面簇，这些簇状结构通过改变HP1a-DNA凝聚相的界面性质和融合动力学，起到了稳定剂的作用。这项工作不仅为理解端粒异染色质的组织和稳定提供了新的生物物理机制框架，也拓展了我们对非编码RNA在调控生物分子凝聚体多相结构和材料性质中作用的认识。研究所揭示的“单一支架蛋白（HP1a）通过差异性地与不同核酸（DNA vs. TERRA）相互作用来驱动不混溶相形成”的机制，与理论预测相符，为理解细胞内复杂区室化的形成原理提供了重要的实验依据。未来，在细胞模型中验证这种多相结构的存在，并整合核小体、庇护蛋白等更多生理因素，将有助于更全面地揭示相分离在端粒生物学和异染色质功能中的核心作用。