FAT-1去饱和酶活性及其底物偏好的测定

《Journal of Lipid Research》：Determination of FAT-1 desaturase activity and substrate preference

n-3多不饱和脂肪酸合成机制与FAT-1去饱和酶活性研究：通过AlphaFold结构预测和突变体分析，确定了FAT-1的活性位点（G212、G216、S217）及底物特异性，发现其能将n-6脂肪酸（如C20:4n6）优先转化为n-3脂肪酸（C20:5n3），并验证了该酶在C. elegans和哺乳动物细胞中的功能一致性。

　　n-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs）在人类健康中扮演着至关重要的角色。这些脂肪酸，如α-亚麻酸（ALA，C18:3n3）、二十碳五烯酸（EPA，C20:5n3）和二十二碳六烯酸（DHA，C22:6n3），参与多种生理功能，包括抗炎作用、脂质调节、促进脑部发育、保护心血管健康等。代谢性n-3 PUFAs的紊乱与多种人类疾病相关，例如炎症和自身免疫性疾病、心血管疾病、癌症、神经退行性疾病、代谢紊乱等。EPA和DHA作为细胞膜的重要成分，能够调节细胞信号传导和基因表达，并且具有抗炎和抗血栓作用，有助于预防心血管疾病。DHA对于大脑和视网膜的发育至关重要，特别是在孕期和婴儿期，其需求尤为显著。此外，n-3 PUFAs已被发现可能改善心理健康问题，如抑郁症和焦虑症，并通过影响肠道微生物群的组成来改善代谢健康。最近的研究还表明，补充n-3 PUFAs可能延缓衰老过程。因此，n-3 PUFAs与健康和长寿密切相关。

然而，哺乳动物，包括人类，由于缺乏Δ12脱饱和酶和Δ15（n-3）脱饱和酶的基因，无法从头合成n-3 PUFAs。Δ12脱饱和酶将油酸（OA，18:1n9）转化为亚油酸（LA，18:2n6），而Δ15脱饱和酶则负责将n-6 PUFAs转化为n-3 PUFAs。因此，人类必须通过饮食或营养补充剂来获取足够的n-3 PUFAs以满足健康需求。相比之下，模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有七种脱饱和酶，包括FAT-1至FAT-7，这些酶能够从头合成包括n-3 PUFAs在内的多不饱和脂肪酸。其中，FAT-1是一种独特的脱饱和酶，能够将n-6 PUFAs转化为n-3 PUFAs。FAT-1基因已被成功表达在多种生物中，如小鼠、猪、羊和鱼类，包括鲤鱼和斑马鱼，其中它能够提高包括ALA、EPA和DHA在内的n-3 PUFAs水平。例如，FAT-1转基因小鼠显示出改善的代谢健康。在斑马鱼中，将FAT-1转基因引入elovl2突变体背景或通过补充DHA，可以有效缓解代谢功能障碍相关脂肪肝病（MAFLD）和肝脏损伤表型。综上所述，这些研究一致表明FAT-1在改善代谢健康方面具有潜在应用价值，但其酶活性和底物特异性仍然未知。

为了揭示FAT-1的酶活性和底物结合位点，我们整合了AlphaFold结构预测、定点诱变和跨物种功能验证的方法。结果表明，FAT-1的活性依赖于特定的氨基酸，如G212、G216和S217。此外，FAT-1表现出对n-6 PUFA底物C20:4n6（花生四烯酸，ARA）向C20:5n3（EPA）转化的偏好。这些发现揭示了FAT-1脱饱和酶的活性和底物选择机制，为FAT-1的转基因应用提供了重要见解。

在秀丽隐杆线虫中，FAT-1能够将四种n-6 PUFAs，包括C18:2n6、C18:3n6、C20:3n6和C20:4n6，转化为对应的n-3 PUFAs，即C18:3n3、C18:4n3、C20:4n3和C20:5n3。由于C18:4n3难以检测，且C18:3n3和Δ19脂肪酸在气相色谱（GC）分析中无法区分，我们选择使用三种n-6 PUFAs，即C18:2n6、C20:3n6和C20:4n6，来确定FAT-1的活性和底物偏好。通过AlphaFold预测结构和分子对接分析，我们确定了多个潜在的结合位点。这些结果为理解FAT-1的功能提供了基础。

在秀丽隐杆线虫中，FAT-1的表达和活性依赖于其N端的CYTB5/DUF3474结构域和C端的脱饱和酶结构域。为了验证这一假设，我们构建了两种截断突变体，Δ1-100（缺少DUF3474结构域）和Δ103-351（缺少脱饱和酶结构域）。结果表明，这两种截断突变体的FAT-1蛋白表达显著降低，且无法恢复n-3 PUFAs水平，进一步证实了这两个结构域对FAT-1功能的不可或缺性。尽管这些突变体的活性丧失可能与蛋白表达水平降低有关，但其具体机制仍需进一步研究。

我们还发现，FAT-1的某些关键氨基酸，如G212、G216和S217，对于其活性至关重要。这些氨基酸位于脱饱和酶结构域的细胞质侧，其突变导致FAT-1蛋白水平下降，从而影响其活性。在秀丽隐杆线虫和哺乳动物细胞中，这些突变均导致FAT-1无法有效将n-6 PUFAs转化为n-3 PUFAs，进一步验证了其重要性。此外，我们在哺乳动物细胞中也发现，FAT-1能够将四种n-6 PUFAs转化为对应的n-3 PUFAs或下游n-3 PUFAs，而不会影响上游n-3 PUFAs的生成。这表明FAT-1具有广泛的底物适应性，但其对C20:4n6向C20:5n3转化的偏好尤为显著。

通过构建FAT-1转基因细胞系，我们进一步验证了其在哺乳动物细胞中的功能。在正常饮食和饥饿条件下，FAT-1均能将外源C18:2n6、C18:3n6、C20:3n6和C20:4n6转化为对应的n-3 PUFAs。特别是在饥饿条件下，FAT-1能够显著提高C20:5n3的水平，而C18:3n3和C20:4n3的水平则相对较低。这说明FAT-1可能优先将C20:4n6转化为C20:5n3。此外，我们在哺乳动物细胞中发现，某些氨基酸的突变，如G212M、G216L和S217R，不仅影响FAT-1的活性，还导致其蛋白水平下降。这表明这些氨基酸在FAT-1的功能中起着核心作用。

为了更深入地理解FAT-1的功能机制，我们还分析了其结构域的相互作用。结果显示，FAT-1的DUF3474结构域可能作为细胞色素b5样结构域，接收来自细胞色素b5还原酶HPO-19/T05H4.4的电子，然后传递给其脱饱和酶结构域以激活n-3 PUFAs的合成。这一过程在秀丽隐杆线虫和哺乳动物细胞中均被证实，但其具体机制仍需进一步研究。此外，我们还发现，FAT-1的某些突变，如Y90T、L210I、H168V-K171H、W264Y和L378M-D379N，虽然不影响其蛋白水平，但显著降低了其活性，这表明这些氨基酸在酶活性中也起着重要作用。

综上所述，本研究通过结构预测、分子对接、定点诱变和跨物种功能验证，揭示了FAT-1脱饱和酶的活性和底物选择机制。这些发现不仅有助于理解FAT-1在生物体内的功能，还为将其应用于转基因技术以改善代谢健康提供了理论依据。未来的研究可以进一步探讨FAT-1在不同物种中的功能差异，以及其结构域在电子传递过程中的具体作用，从而为相关疾病的治疗和预防提供新的思路。