中欧家猫与流浪猫隐孢子虫新型gp60亚型鉴定及遗传多样性研究

《Parasites & Vectors》：Novel gp60 subtypes and genetic diversity of Cryptosporidium felis in domestic and stray cats from Central Europe

本研究针对中欧地区猫源隐孢子虫(Cryptosporidium felis)基因分型数据缺乏的问题，通过gp60基因分型技术对捷克、波兰和斯洛伐克的711份猫粪便样本进行分析，首次发现5个属于XIXa亚型家族的新亚型，揭示流浪猫感染率(6.7%)显著高于家猫(2.3%)，为理解该人兽共患病原的地理分布和传播风险提供重要依据。

　　

在当今社会，家猫(Felis catus)已成为人类重要的伴侣动物，全球宠物猫数量达3.5-3.7亿只，而流浪猫群体更是高达4.8亿只。这些毛茸茸的伙伴虽然为人类带来精神慰藉，却也潜藏着人兽共患病的传播风险。其中，隐孢子虫(Cryptosporidium)作为一种重要的肠道寄生原虫，尤其值得关注。这种寄生虫可引发 cryptosporidiosis（隐孢子虫病），临床表现为水样腹泻、腹痛和恶心，对幼龄、免疫功能低下个体及非特异性宿主危害尤为严重。

猫群中主要流行的Cryptosporidium felis（猫隐孢子虫）被认定为具有人兽共患潜力，特别是在卫生条件欠佳地区可能对人类健康构成威胁。然而，关于该病原体在中欧地区的遗传特征和流行情况，科学界知之甚少。以往的研究多集中于Cryptosporidium parvum（小隐孢子虫）和Cryptosporidium hominis（人隐孢子虫）等物种，对C. felis的分子流行病学研究仍存在明显空白。更重要的是，目前全球范围内对C. felis的gp60（60 kDa糖蛋白）基因分型研究十分有限，缺乏系统的亚型分类和地理分布数据。

为填补这一知识空白，由Veronika Zikmundová领衔的研究团队开展了一项针对中欧地区猫源C. felis的分子流行病学研究。研究人员从捷克共和国、斯洛伐克和波兰南部地区共采集了711份猫粪便样本（家猫350份，流浪猫361份），通过先进的分子生物学技术对病原进行检测和分型，旨在揭示C. felis在该地区的流行特征和遗传多样性。

研究方法上，团队采用多技术联用策略：首先通过苯胺-石炭酸-甲基紫染色法进行显微镜检测，随后利用巢式PCR（聚合酶链式反应）扩增小亚基核糖体RNA基因(18S rDNA)进行物种鉴定，并对gp60基因进行测序分型。样本来源明确标注为家猫（室内饲养）和流浪猫（动物收容所或农场周边）。系统发育分析采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和通用时间可逆模型(General Time Reversible model)，通过1000次bootstrap（自举法）检验评估分支支持度。统计学分析使用卡方检验比较感染率差异。

研究结果

隐孢子虫在猫中的发生和流行率

在所有711份样本中，显微镜检测均未观察到隐孢子虫卵囊，但分子检测显示总感染率为4.5%(32/711)。地域分布上，捷克共和国感染率最高(5.1%)，斯洛伐克(4.2%)和波兰(4.0%)相近。尤为重要的是，流浪猫的感染率(6.7%)显著高于家猫(2.3%)，统计学分析显示流浪猫感染C. felis的风险是家猫的3.04倍(P=0.0086)。所有阳性样本经测序确认均为C. felis感染，且未发现混合感染。

Cryptosporidium felis的分子分型

gp60基因分析揭示了5个新的C. felis亚型，均属于XIXa亚型家族。系统发育分析显示这些亚型形成5个具有高支持度的独立集群，且与全球已报道的猫或人源亚型均不相同。家猫中仅发现一种亚型（集群1），而流浪猫中则存在全部5种亚型。这些亚型呈现明显的地理分布特征：集群1分布最广，在三国均有发现；集群2仅见于捷克和波兰；集群3为斯洛伐克特有；集群4和5仅出现在捷克地区。

序列分析发现亚型间存在显著的长度多态性，主要由重复序列数量差异导致。R1重复序列（33 bp）在集群1中为单拷贝，R2重复序列（39 bp）的拷贝数在集群3、4、5中分别为1、2、3个。末端GTT三核苷酸重复数在集群1和2中为两个，集群3-5中均为四个。

讨论与结论

本研究首次系统揭示了中欧地区C. felis的遗传多样性和地理分布特征。4.5%的总感染率与欧洲多数研究结果一致，但显著低于德国报告的21.2%。所有阳性样本均鉴定为C. felis，这与该物种对猫的宿主特异性相符。以往研究中偶尔检测到的C. muris（鼠隐孢子虫）、C. parvum等物种可能源于猫捕食啮齿类动物或接触污染环境后的机械性携带，而非真正感染。

流浪猫显著更高的感染率(6.7% vs 2.3%)凸显了生活环境对疾病传播的影响。流浪猫更频繁接触污染环境、捕食携带病原的猎物，且缺乏医疗干预，导致感染风险增加。这一发现与全球多项研究结果一致，强调了流浪猫群体在疾病传播中的特殊地位。

gp60基因作为隐孢子虫分型的"金标准"，其高变区为亚型鉴定提供了可靠标记。本研究发现的5个新亚型均属于XIXa家族，该家族是全球C. felis中最常见的亚型家族。亚型呈现的地理聚类模式提示可能存在地域适应性进化，这与C. parvum和C. hominis中观察到的现象相似。然而，由于当前C. felis分型数据有限，这一结论仍需更多研究验证。

值得注意的是，所有感染猫均无临床症状，这可能与研究对象均为成年健康个体有关。成年猫感染后通常仅排出少量卵囊，这解释了为何显微镜检测均为阴性，而高灵敏度的PCR却能检出病原DNA。这一现象强调了分子检测在隐性感染诊断中的重要性。

关于人兽共患潜力，本研究发现的XIXa家族亚型尚未在人类感染中报道，其公共卫生意义有待评估。以往研究表明，XIXb、XIXd和XIXe家族主要感染人类，而XIXa和XIXc家族具有人兽共患潜力。与C. parvum的IIc家族主要感染人类类似，C. felis不同亚型家族可能也存在宿主偏好性。

本研究存在的局限性包括样本量相对有限，且未能评估亚型与致病性的关联。未来需要更大规模的监测，并结合临床数据、宿主免疫状态分析，才能全面揭示C. felis亚型的生物学意义和公共卫生重要性。

综上所述，这项研究显著拓展了我们对C. felis遗传多样性的认知，为理解该病原在中欧地区的流行病学提供了重要基础数据。研究结果强调需加强对流浪猫群体的疾病监控，并提示有必要进一步评估新发现亚型的人兽共患风险。随着人类与伴侣动物接触日益密切，这类研究对保障公共健康和生态系统平衡具有深远意义。