利什曼原虫感染诊断新突破：GLP级重组抗原在全血检测中的潜力评估

《Parasites & Vectors》：Diagnostic potential of GLP recombinant antigens in whole blood assays for Leishmania infantum infection

本研究针对当前利什曼原虫感染诊断中可溶性抗原（SLA）难以标准化生产的瓶颈，系统评估了11种重组抗原在细胞增殖实验（CPA）和全血检测（WBA）中的免疫反应特性。研究发现，ENSC抗原通过诱导IP-10可高效识别治愈的内脏利什曼病（CVL，90%灵敏度），而ΔCpB抗原通过激发TNF能有效检测治愈的皮肤利什曼病（CCL，71.4%灵敏度）。这些符合GLP生产规范的重组抗原为开发标准化诊断工具及疫苗设计提供了新策略。

　　

在热带与亚热带地区的69个国家中，利什曼病每年困扰着超过27万人，其中内脏利什曼病（VL）和皮肤利什曼病（CL）是最主要的临床形式。更棘手的是，20%-60%的感染者并无明显症状，成为潜在的传染源，极大增加了疾病防控的难度。当前，诊断利什曼感染尤其是无症状感染和评估治疗效果，高度依赖一种名为可溶性利什曼抗原（SLA）的试剂。然而，SLA的制备过程复杂，且难以在“药品生产质量管理规范”（GMP）条件下进行标准化生产，这严重限制了其广泛应用和诊断的可靠性。

为此，研究团队将目光投向了重组抗原技术。重组抗原可通过工程菌大规模生产，易于标准化，且符合GMP要求，是替代SLA的理想候选者。本研究的核心目标，就是筛选出能够有效激发保护性免疫反应（特别是Th1型反应）的重组抗原，用于优化全血检测（WBA），从而更准确地在流行区识别出已治愈的VL和CL患者，以及那些携带病原体却未发病的无症状感染者。

为达成这一目标，研究人员运用了几个关键技术：首先，他们通过细胞增殖实验（CPA）对11种候选重组抗原进行了初步筛选，实验样本来自61名经证实体内利什曼原虫已被清除（无论是通过治疗还是自发清除）的个体。其次，他们利用流式细胞术的细胞因子微球阵列（Cytometric Bead Array）精准量化了抗原刺激后产生的关键细胞因子和趋化因子，如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF）、白细胞介素-2（IL-2）、IP-10（CXCL10）等。最终，最具潜力的抗原在被选入全血检测（WBA）中进行验证，该检测使用了来自53名志愿者的血液样本，这些志愿者被明确分为治愈的VL患者、治愈的CL患者、无症状感染者和健康对照组。所有研究参与者均来自西班牙马德里的一个利什曼病高发区。

重组抗原筛选与Th1免疫反应特征

初步的细胞增殖实验显示，在11种重组抗原中，ΔCpB、NSC和ENSC能够显著刺激来自免疫应答组（LiR）的外周血单核细胞（PBMC）增殖，并诱导高水平的IFN-γ和TNF分泌，同时仅产生低水平的免疫抑制性细胞因子IL-10。这种反应模式是典型的保护性Th1免疫反应的特征，提示这三种抗原能有效唤起机体对利什曼原虫的免疫记忆。因此，它们被选入后续的全血检测进行深入评估。

全血检测中抗原特异性细胞因子反应谱

在全血检测中，研究人员观察到，治愈的VL和CL患者以及无症状感染者在受到ΔCpB、NSC或ENSC刺激后，均产生了显著高于健康对照组的IFN-γ。特别是在治愈的VL组中，ENSC抗原刺激后IP-10的产生量尤为突出。而治愈的CL患者则对ΔCpB抗原刺激产生的TNF反应最为显著。对于无症状感染者，NSC和ENSC抗原诱导的IL-2和IP-10水平虽有升高，但识别能力相对温和。

最佳抗原-细胞因子组合的诊断效能评估

通过系统分析，研究团队确定了针对不同人群的最优检测组合。对于治愈的VL患者，使用ENSC抗原检测IP-10的灵敏度高达90%，虽然其绝对产量较SLA刺激时低约8倍，但区分度良好。对于治愈的CL患者，ΔCpB抗原结合TNF检测的灵敏度为71.4%，且TNF产量与SLA刺激相当，显示了良好的应用潜力。而对于无症状感染者，NSC或ENSC抗原结合IL-2或IP-10检测能达到60%的识别率，尽管效果为中等，但仍提供了有价值的检测方向。颗粒酶B（Granzyme B）和IP-10在部分健康对照中也有微量检出，提示其在诊断特异性上需谨慎考量。

本研究证实，ENSC和ΔCpB这两种在GLP（良好实验室规范）条件下生产的重组抗原，在全血检测中展现出替代SLA的巨大潜力。ENSC/IP-10组合为治愈的内脏利什曼病确认提供了高灵敏度的工具，而ΔCpB/TNF组合则对治愈的皮肤利什曼病检测具有重要价值。这不仅为开发标准化、易于推广的利什曼病诊断试剂奠定了坚实基础，而且这些能有效激发保护性Th1免疫反应的抗原本身，也是未来亚单位疫苗的杰出候选者。尽管在无症状感染者识别方面效能尚有提升空间，但此项研究无疑为在利什曼病流行区实现更精准的病例管理、治疗效果评估和传染源控制开辟了新的路径。研究成果发表于《Parasites & Vectors》期刊，为全球抗击这一被忽视的热带疾病贡献了重要的科学证据。