巴西首报：褐狗蜱电压门控钠离子通道基因突变介导拟除虫菊酯类杀虫剂抗性

《Parasites & Vectors》：First report of VGSC mutations for resistance to synthetic pyrethroids in brown dog ticks (Rhipicephalus sanguineus sensu stricto) from Brazil

本研究针对巴西褐狗蜱（Rhipicephalus sanguineus sensu stricto）对常用杀虫剂拟除虫菊酯产生抗性的问题，通过新一代测序技术分析了10只采自流浪犬的蜱虫样本。研究首次在美洲的严格意义褐狗蜱中鉴定出VGSC基因上的两个抗性突变（C190A和G215T），并开发了G215T的实时基因分型检测方法。该发现为监测和治理蜱虫抗药性提供了关键分子工具，对控制蜱媒疾病传播具有重要意义。

　　

在人类与犬只共生的环境中，一种不起眼却危害巨大的生物——褐狗蜱（Rhipicephalus sanguineus sensu lato, s.l.），正悄然成为公共卫生的威胁。这类蜱虫是全球性分布的体外寄生虫，不仅直接叮咬引起不适，更是多种病原体的重要传播媒介，包括影响犬只的犬巴贝斯虫（Babesia vogeli）和犬埃立克体（Ehrlichia canis），以及威胁人类的落基山斑点热（由Rickettsia rickettsii引起）等立克次体病的病原体。控制褐狗蜱种群，尤其是在犬只身上及其栖息环境中的控制，长期以来高度依赖化学杀虫剂，其中合成拟除虫菊酯（Synthetic Pyrethroids）因其高效性而被广泛应用。这类杀虫剂的作用靶点是节肢动物神经细胞上的电压门控钠离子通道（Voltage-Gated Sodium Channel, VGSC）蛋白，通过干扰钠离子内流最终导致害虫麻痹死亡。然而，过度和不科学的使用催生了抗药性问题。

在美洲，入侵的褐狗蜱复合群主要包含两个谱系：温带谱系（现确认为严格意义的褐狗蜱 Rhipicephalus sanguineus sensu stricto, s.s.）和热带谱系（Rhipicephalus linnaei）。尽管在巴拿马、加勒比地区、美国等多地的褐狗蜱种群中均已观察到对合成拟除虫菊酯的表现型抗性，但在巴西，此前仅在里奥格兰德苏尔州（Rio Grande do Sul）的一个经过验证的严格意义褐狗蜱种群中报告过此类抗性。更重要的是，对杀虫剂抗性背后分子机制的理解，特别是VGSC基因突变（即击倒抗性，kdr）的认知，在美洲的严格意义褐狗蜱中几乎空白。已知在美洲的热带谱系褐狗蜱（Rh. linnaei）以及印度等地的褐狗蜱中，已发现特定的VGSC突变（如T2134C, C190A, G215T）与拟除虫菊酯抗性相关。因此，查明巴西流行的严格意义褐狗蜱种群中是否存在类似的抗性突变，对于制定有效的蜱虫管理策略、延缓抗性发展至关重要。

为了回答这一问题，由Kleinschmidt等人开展的研究，对来自巴西阿雷格里港（Porto Alegre）雷斯蒂加（Restinga）分区一只流浪犬身上的10只严格意义褐狗蜱进行了深入分析。这些蜱虫的后代在之前的幼虫包裹测试（Larval Packet Test, LPT）中已显示出对溴氰菊酯（Deltamethrin）的低水平抗性（抗性比为5.67），这提示该野外种群可能存在抗药性基础。研究人员设定了两个明确目标：首先，利用分子方法确认这些蜱虫的分类学地位（确认为Rh. sanguineus s.s.）；其次，筛查其VGSC基因中是否携带已知与拟除虫菊酯抗性相关的突变。

本研究主要运用了几项关键技术。首先是基于新一代测序（Next-Generation Sequencing）的多重PCR扩增子测序（AmpSeq）技术，针对VGSC基因的关键结构域（特别是II区第4-5片段和III区第6片段）以及三个线粒体基因（12S rRNA, 16S rRNA, COI）进行扩增和高通量测序，以实现高精度突变检测和物种鉴定。其次，利用实时荧光定量PCR（qPCR）基因分型技术，对测序发现的突变位点（C190A和G215T）进行快速、特异的验证，并为G215T突变新开发了一种检测方法。此外，辅以Sanger测序对关键区域进行确认，并利用最大似然法（Maximum Likelihood）进行系统发育分析，以确定蜱虫的谱系归属。研究所用的10只蜱虫（3只成年雌蜱和7只若蜱）样本来源于巴西伊研究所（IPVDF）的既往库存，采集自同一只流浪犬。

结果

系统发育分析确认物种身份

通过对线粒体COI基因部分序列（346 bp）进行系统发育分析，确认这10只雷斯蒂加蜱虫与已知的严格意义褐狗蜱（温带谱系）参考样本聚为一支，支持率（Bootstrap）高。12S和16S基因序列分析也得出相同结论，所有10只蜱虫在这三个线粒体基因上序列一致，从而从分子水平证实了它们属于严格意义褐狗蜱（Rh. sanguineus s.s.）。

VGSC基因抗性突变鉴定

对VGSC基因的深度测序分析揭示了关键发现。在10只蜱虫中，有2只检测到已知与拟除虫菊酯抗性相关的非同义单核苷酸多态性（SNPs），且均为杂合子。其中一只蜱虫（Rs_Restinga_04）携带C190A突变，该突变导致VGSC蛋白第925位亮氨酸被异亮氨酸取代（L925I）。另一只蜱虫（Rs_Restinga_07）携带G215T突变，导致第933位甘氨酸被缬氨酸取代（G933V，也称为G72V）。针对这两个位点进行的特异性qPCR基因分型 assay 以及随后的Sanger测序均证实了这些突变的存在。这两只蜱虫在其他已知的抗性相关位点（如核苷酸位置170和2134）均表现为敏感型纯合子。这是首次在美洲的严格意义褐狗蜱中报道C190A和G215T这两个VGSC抗性突变。

GABA-Cl基因分析

研究人员还筛查了与杀虫剂非班腈（Fipronil）和狄氏剂（Dieldrin）抗性相关的GABA门控氯离子通道（GABA-gated chloride channel, GABA-Cl）基因。分析表明存在三个基因拷贝（α, β, γ）。6只雷斯蒂加蜱虫携带GABA-Cl-β拷贝的等位基因2（RsGABAchannel_beta_A02），该等位基因包含A301S氨基酸替换，此替换在其他节肢动物中与狄氏剂/非班腈抗性相关。但本研究未对非班腈抗性进行表型测试，因此该等位基因在褐狗蜱中是否导致抗性尚不明确。

讨论

本研究通过分子证据首次确认，巴西里奥格兰德苏尔州的严格意义褐狗蜱种群中出现了VGSC基因的抗性突变（C190A和G215T）。虽然样本量较小，但这一发现具有重要意义。它表明，在巴西乃至南美洲其他地区，用于犬只体外寄生虫控制的合成拟除虫菊酯类药物的长期使用，可能已经对当地蜱虫种群产生了选择压力，导致了抗性基因型的出现。尽管这些突变在褐狗蜱中的表型-基因型关联尚未在本研究或该地区得到直接验证（由于缺乏可用于测试的蜱虫样本），但它们在其它蜱种（如牛蜱 Rhipicephalus microplus）和昆虫中已被证实可导致抗性。研究发现仅有两只为抗性突变杂合子，且其来源犬只的F1代幼虫对溴氰菊酯仅表现出低水平抗性（抗性比5.67），这与抗性等位基因频率较低的情况是相符的。然而，杂合子个体的存在是一个警示信号，在缺乏科学管理策略的情况下，持续使用同类杀虫剂可能迅速筛选出纯合抗性个体，导致抗性大规模扩散。

除了靶标突变（如VGSC突变）外，代谢解毒机制也可能在褐狗蜱对拟除虫菊酯的抗性中发挥作用。因此，未来的研究需要结合表型检测（如标准化的幼虫包裹测试）和更广泛的基因分型，以全面了解巴西褐狗蜱的抗性现状和机制。本研究开发的G215T突变实时基因分型方法为快速、大规模筛查该突变提供了实用工具。

结论

该研究首次在美洲的严格意义褐狗蜱（Rh. sanguineus s.s.）中发现了VGSC基因的C190A和G215T突变，为合成拟除虫菊酯抗性提供了分子证据。这一发现强调了在巴西及南美其他存在褐狗蜱侵扰的国家，利用遗传学工具（如扩增子测序和实时PCR）监测抗性等位基因频率的紧迫性和重要性。有效的抗性监测是制定合理蜱虫管理策略、延缓抗性发展的基石。未来的研究方向应扩大地理采样范围，整合表型与基因型数据以验证突变的功能，并探索除化学防治外的替代策略（如抗蜱疫苗），从而更有效地控制褐狗蜱种群，减少其传播疾病的风险。研究成果发表于《Parasites & Vectors》期刊，为热带病媒介控制领域提供了重要的科学依据。