纤维状纳米材料在肺暴露后肝脏定位的形状与尺寸依赖性差异及其对肝组织病理学的影响

《Particle and Fibre Toxicology》：Fiber length and shape-dependent differences in hepatic nanomaterial localization in mice following pulmonary exposure

本研究针对吸入性纳米材料易从肺部易位至肝脏并引发潜在毒性反应的关键问题，系统探究了不同形状（纤维状 vs. 球形）和尺寸（长/厚 vs. 短/薄）的纳米材料在小鼠肺暴露后于肝脏中的长期（1-12个月）定位分布规律。研究发现，长而厚的纤维状纳米材料（如MWCNTs）更易定位于肝实质细胞，而球形TiO2纳米颗粒和短TiO2纳米管则主要富集于非实质细胞（如Kupffer细胞）和肝窦/血管中。此外，暴露一年后，短而薄的MWCNTs可诱导轻微的肝脏组织病理学改变，而长而厚的纤维则未观察到明显变化。该研究揭示了纳米材料的形状和尺寸是其肝脏定位、清除途径及潜在毒性的关键决定因素，为纳米材料的安全性评估提供了重要依据。

　　

随着纳米技术的飞速发展，高长径比纳米材料（High Aspect Ratio Nanomaterials, HARN），如碳纳米管（Carbon Nanotubes, CNTs）和纳米线，因其独特的物理化学性质，在电子、复合材料、能源存储以及生物医学领域（如药物递送）展现出巨大的应用潜力。然而，其在生产和应用过程中的职业暴露风险也引起了广泛关注。研究表明，吸入的纳米材料可以从肺部易位进入体循环，并到达肝脏这一主要的次级蓄积器官，可能引发肝毒性、基因表达改变、急性期反应甚至系统性效应（如心血管疾病）。因此，理解吸入性纳米材料在肝脏中的分布、清除机制及其与肝细胞的相互作用，对于评估其生物安全性和潜在健康风险至关重要。

目前，关于纳米材料肝脏定位的体内研究多集中于球形颗粒，普遍发现其主要被肝脏中的巨噬细胞——库普弗细胞（Kupffer cells）吞噬。然而，对于形状各异的纤维状纳米材料在肝脏中的命运，我们知之甚少。它们的形状和尺寸是否会改变其在肝脏细胞间的分布模式？这种不同的定位是否与不同的清除途径和毒性效应相关？为了回答这些问题，来自丹麦国家工作环境研究中心等机构的研究团队在《Particle and Fibre Toxicology》上发表了一项重要研究，系统比较了五种不同纤维状纳米材料（包括三种多壁碳纳米管MWCNTs、磷化镓纳米线GaP NW和短二氧化钛纳米管TiO₂ tube）与球形二氧化钛纳米颗粒（TiO₂ NP）在小鼠肺暴露后长达一年内的肝脏定位差异，并评估了长期暴露对肝脏组织形态的影响。

为开展此项研究，研究人员主要运用了以下关键技术：1）利用气管内滴注（Intratracheal Instillation）方式建立小鼠肺暴露模型；2）采用增强暗场显微镜（Enhanced Darkfield Microscopy）对肝组织石蜡切片中的纳米材料进行高对比度成像和手动计数，分析其在不同解剖位置（肝细胞、非实质细胞、肝窦/血管、其他定位）的分布；3）通过针对肝细胞核因子4α（HNF4α）和巨噬细胞标志物CD68的免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）染色，验证纳米材料的细胞定位；4）对暴露一年后的肝组织进行苏木精-伊红（H&E）染色，并由研究者（先知情后盲法）评估组织病理学变化。研究所用肝组织样本来源于该团队此前已发表的多项研究以及一项新的关于Mitsui-7 MWCNT的研究。

纳米材料肝内定位的形状差异

研究人员首先评估了肺暴露后1个月时，六种不同纳米材料在肝脏中的分布。结果显示，形状和尺寸显著影响其定位。球形TiO₂ NP和短TiO₂ tube更倾向于位于非实质细胞（主要是库普弗细胞）和肝窦/血管内。相比之下，长而厚的纤维状纳米材料（如NM-401, Mitsui-7 MWCNTs, GaP NW）以及长而薄的原始MWCNT（Pristine CNT）则更多地出现在“其他定位”类别中，并且有少量但可检测到的部分位于肝细胞内。免疫组化验证表明，“其他定位”的纳米材料大多位于肝实质内。这种分布差异在暴露后3个月以及6/12个月时依然存在且模式相似，表明长纤维更易进入肝实质，而球形颗粒和短管则更易被非实质细胞捕获或滞留于血管空间。

Mitsui-7纤维在肝脏中的动态变化

为了解纤维在肝脏中的滞留和清除动力学，研究人员重点追踪了Mitsui-7 MWCNT在暴露后3、24、31、90和360天的肝脏负荷和定位变化。结果发现，肝脏中的纤维浓度在暴露后早期（至90天）显著增加，表明纳米材料从肺部持续易位至肝脏。然而，在暴露后360天时，肝脏纤维浓度显著下降，估算其肝脏半衰期约为135天，提示肝脏对纤维存在缓慢的清除过程。同时，纤维的定位也随时间发生变化：在晚期时间点（90和360天），位于非实质细胞中的纤维比例增加，而位于肝窦/血管中的比例减少，表明随着时间推移，更多的纤维被肝脏内的吞噬细胞摄取或从循环中清除。

组织病理学改变

暴露一年后的组织学检查发现，暴露于长而厚的MWCNTs（Mitsui-7和NM-401）的小鼠肝脏，其组织学改变发生率与对照组无显著差异。然而，暴露于几种短而薄或中等长度的MWCNTs（如NRCWE-040, -041, -042, -046, -047, -048）以及碳黑参照颗粒Printex 90，则观察到某些非肿瘤性改变的发病率显著高于对照组，包括胆小管或小静脉周围结缔组织轻度增生、库普弗细胞核显著以及肝细胞核增大深染等。这些改变的严重程度均为轻微。结果表明，长而厚的纤维状纳米材料在单次肺暴露一年后未引起明显的肝脏形态学改变，而短而薄的纤维和球形碳黑颗粒则与某些轻微的组织反应相关。

综上所述，这项研究清晰地表明，纳米材料的形状和尺寸是决定其肺暴露后肝脏内定位、滞留时间和潜在组织效应的关键因素。长纤维状材料更易穿透肝窦内皮进入肝实质，可能通过胆道系统等途径被清除，而球形和短纤维材料则更多地被肝脏的免疫细胞（库普弗细胞）处理。这种不同的“旅途”终点可能解释了为何长纤维在长期观察中未引发显著的组织病理学改变，而短纤维和球形颗粒则与轻微的肝脏组织反应相关。该研究不仅深化了我们对纳米材料生物分布和清除机制的理解，而且强调了在纳米毒理学和纳米材料安全性设计中，必须充分考虑其物理形态参数的重要性，为未来开发更安全的纳米材料提供了重要的科学依据。