靶向CEA的纳米抗体CE-21：一种用于68Ga PET成像和177Lu放射性同位素治疗的新型诊疗一体化平台临床前及首次人体评估

《Journal of Nanobiotechnology》：A high-affinity CEA-targeted nanobody for 68Ga PET imaging and 177Lu-based radioisotope therapy: preclinical and first-in-human evaluation

本研究针对当前靶向癌胚抗原(CEA)的完整抗体存在药代动力学差、肿瘤穿透性有限及成像延迟等问题，开发了一种新型高亲和力抗CEA纳米抗体CE-21。通过位点特异性标记68Ga或177Lu，实现了结直肠癌模型的高对比度PET/CT成像和有效的放射核素治疗，并在健康志愿者中展现出良好的安全性和药代动力学特征，为CEA阳性肿瘤的精准诊疗提供了有前景的解决方案。

　　

在精准肿瘤学时代，对肿瘤生物标志物进行精确的体内成像和靶向治疗是提高疗效的关键。癌胚抗原(CEA; CEACAM5)作为一种在结直肠癌等多种上皮源性恶性肿瘤中过度表达的细胞表面糖蛋白，是国际公认的重要肿瘤诊断、分期、预后评估和治疗靶点。尽管血清CEA检测在临床上被广泛用于监测疾病负荷，但这种方法仅能提供CEA水平的系统测量，无法揭示病灶的空间分布，对小转移灶的检测灵敏度不足，且容易出现假阳性或假阴性结果。这些局限性凸显了对能够实现CEA特异性体内靶向和可视化的分子探针的迫切需求。

传统的靶向CEA方法主要依赖于完整单克隆抗体，如用于放射免疫治疗(RIT)的¹³¹I labetuzumab。虽然这些基于IgG(免疫球蛋白G)的药物在临床前和临床研究中显示出CEA特异性靶向能力，但其临床应用受到不利药代动力学的限制。完整抗体分子量约为150 kDa，血清半衰期长达数周，导致血液循环清除缓慢，造成非靶组织(如骨髓)的长期辐射暴露和血液学毒性。此外，其大分子尺寸限制了肿瘤穿透能力，导致肿瘤内分布不均。缓慢的清除速度和有限的组织穿透性也损害了成像对比度，通常需要延迟数天进行成像，这与¹⁸F和⁶⁸Ga等短半衰期正电子发射断层扫描(PET)同位素难以兼容。

为了克服这些障碍，研究人员探索了更小的抗体片段(Fab、F(ab')₂、scFv)，它们具有更快的血液清除速度和改善的肿瘤穿透性。然而，这些片段也面临挑战，包括高肾脏摄取带来的潜在肾毒性、亲和力降低以及有限的体内稳定性，这些因素制约了其临床转化。

纳米抗体(VHHs)，即源自骆驼科动物重链抗体的单域抗原结合片段，为这些局限性提供了创新性解决方案。纳米抗体分子量仅为约15 kDa，具有快速血液清除、深层组织穿透和高稳定性等特性。这些药代动力学特性使得纳米抗体在给药后数小时内即可有效富集于肿瘤，产生优异的成像对比度。重要的是，其快速清除特性与短半衰期PET同位素的半衰期非常匹配，从而支持同日成像，同时最大限度地减少患者的辐射暴露。纳米抗体还具有低免疫原性，并且易于进行模块化位点特异性偶联，使其成为极具吸引力的诊断和治疗应用平台。

在临床前研究中，靶向HER2、PD-L1和PSMA的纳米抗体示踪剂已显示出令人鼓舞的结果，包括¹⁷⁷Lu标记构建体强大的治疗功效。尽管取得了这些进展，但靶向CEA的纳米抗体的开发仍然有限。大多数已报道的抗CEA纳米抗体仅在荧光或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像中进行评估，通常仅显示纳摩尔级的亲和力，并且依赖于随机的基于赖氨酸的标记策略。这种方法会引入产物异质性，并可能损害抗原结合。迄今为止，尚未有优化的CEA纳米抗体平台系统地整合高分辨率PET成像、¹⁷⁷Lu放射免疫治疗(RIT)和人体剂量学评估。

为了应对这一挑战，研究人员在《Journal of Nanobiotechnology》上发表了他们的最新成果。他们旨在开发一种新型的高亲和力抗CEA纳米抗体，用于结直肠癌的PET成像和放射核素治疗。本研究通过骆驼免疫库噬菌体展示技术筛选出高亲和力抗CEA纳米抗体CE-21，采用位点特异性偶联策略确保标记均一性，在临床前模型中评估了[⁶⁸Ga]Ga-CE-21的成像性能和[¹⁷⁷Lu]Lu-CE-21的治疗效果，并首次在健康志愿者中进行了[⁶⁸Ga]Ga-CE-21的安全性、药代动力学和剂量学研究。

本研究采用了几项关键技术方法：利用骆驼免疫和噬菌体展示技术筛选高亲和力抗CEA纳米抗体；通过工程化C末端半胱氨酸进行位点特异性NOTA螯合剂偶联，以实现⁶⁸Ga或¹⁷⁷Lu的精确标记；在LS174T结直肠癌荷瘤鼠模型中进行Micro-PET/CT成像、生物分布和治疗效果评估；招募健康志愿者进行首次人体PET/CT研究以评估安全性、药代动力学和辐射剂量学。

筛选和表征抗CEA纳米抗体

为了获得对人癌胚抗原(CEA)具有高亲和力的纳米抗体，研究人员用重组CEA蛋白免疫骆驼，并构建了免疫衍生的噬菌体展示库。经过六轮免疫后，血清中的抗体滴度通过ELISA(酶联免疫吸附测定)监测，即使在1:32,000的稀释度下仍能检测到强结合信号，证实成功诱导了高滴度的CEA特异性抗体。随后分离外周血单核细胞(PBMCs)用于库构建。高通量测序显示约74%的克隆序列含有典型的纳米抗体结构特征，证明了库的多样性和功能相关性。经过三轮针对CEA的噬菌体淘选，Output/Input比率逐渐增加，表明CEA特异性结合物的富集。间接ELISA筛选出135个OD值大于2.0的阳性克隆，消除冗余后获得44个独特的纳米抗体序列。

代表性纳米抗体在哺乳动物细胞中表达，并使用生物层干涉技术(BLI)分析其结合亲和力。CE-21、CE-85和CE-88的平衡解离常数(K_D)分别为289 pM、87.8 pM和25.6 pM，显著优于先前报道的抗CEA纳米抗体的亲和力。ELISA进一步证明了CE-21、CE-85和CE-88与CEA的剂量依赖性结合，其EC₅₀值分别为1.77μM、1.059μM和1.198μM。流式细胞术证实了它们能够特异性识别LS174T细胞表面的CEA。随后评估了纳米抗体的生物物理稳定性。所有三种纳米抗体的熔解温度(T_m)均高于69°C，聚集起始温度(T_agg)分别为57.1°C、49.35°C和67.94°C，多分散指数(PDI)低于0.2，表明具有强大的热稳定性和溶液均一性。为了模拟标记条件，在加速稳定性测定中将纳米抗体置于高温、酸性环境中。CE-21和CE-88保持了其结合活性，EC₅₀值没有显著变化，而CE-85在相同条件下失去了活性。作为比较，商业抗体阿达木单抗和曲妥珠单抗迅速失去结合能力，进一步强调了纳米抗体在恶劣条件下的卓越耐受性。基于其高亲和力、特异性和物理化学稳定性的综合优势，CE-21和CE-88被选为先导候选分子用于后续研究。

放射性标记纳米抗体的表征和细胞靶向

为了实现放射性标记，选定的CEA纳米抗体与螯合剂NOTA进行了位点特异性偶联。在每个纳米抗体的C末端引入一个Gly-Gly-Cys三肽标签，以便在TCEP(三(2-羧乙基)膦)还原后为与马来酰亚胺-NOTA的共价反应提供可控的巯基。该策略确保了均一的偶联，同时保留了抗原结合活性，从而克服了传统非特异性偶联方法的局限性。非还原SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)显示，未偶联的纳米抗体制剂中存在二聚体物种，这可能是由于暴露的巯基形成二硫键所致。偶联后，仅观察到单体条带，表明巯基-马来酰亚胺反应有效阻止了二聚化并改善了分子均一性。ELISA进一步证实NOTA偶联不影响纳米抗体的抗原结合活性，EC₅₀值保持不变。SEC-HPLC(尺寸排阻色谱-高效液相色谱)分析支持了这些发现：CE-88在偶联前显示双峰分布，表明存在部分聚集，但偶联后变为单一尖锐峰；CE-21在偶联前后均显示单分散性，偶联后峰分辨率提高。高分辨率质谱证明两种纳米抗体-NOTA偶联物的药物抗体比率(DAR)均为1，证实了在工程化C末端半胱氨酸处进行了位点特异性修饰。

随后，纳米抗体用⁶⁸Ga进行标记，并使用C18柱纯化。放射性薄层色谱(Radio-TLC)分析表明，[⁶⁸Ga]Ga-CE-21和[⁶⁸Ga]Ga-CE-88的放射化学产率(RCY)分别为43.6±3.9%和39.6±2.9%，放射化学纯度(RCP)大于99%。体外稳定性测定表明，两种示踪剂在盐水和血清中均保持高度稳定，6小时内RCP值大于90%。然后使用过表达CEA的LS174T细胞评估了CEA特异性细胞靶向。摄取研究表明，放射性标记的纳米抗体在90分钟内逐渐积累，其中[⁶⁸Ga]Ga-CE-21显示出最高的摄取量(90分钟时为8.39±0.04% ID)，其次是[⁶⁸Ga]Ga-CE-88(6.95±0.27% ID)。与[⁶⁸Ga]Ga-CE-21延长孵育时间，在180分钟时摄取量进一步增加至10.50±0.21% ID。阻断实验证实了特异性：用过量未标记的CE-21预孵育，在60分钟时将摄取量从6.62±0.21% ID降低到0.99±0.15% ID。最后，通过将LS174T细胞与浓度高达150μg/mL的[⁶⁸Ga]Ga-CE-21一起孵育来评估细胞毒性。未观察到细胞活力的显著降低，表明其具有优异的生物相容性。

LS174T荷瘤鼠中放射性标记纳米抗体的肿瘤靶向PET/CT成像

为了评估放射性标记纳米抗体的体内肿瘤靶向性能，在LS174T异种移植瘤小鼠中进行了动态PET/CT成像。静脉注射[⁶⁸Ga]Ga-CE-21后，在皮下LS174T部位观察到快速的肿瘤积累。定量分析显示，在10、30和60分钟时，肿瘤摄取值分别为2.10±0.18、2.73±0.06和3.68±0.05% ID/g。肿瘤与背景的对比度随时间推移而改善，60分钟时肿瘤与肌肉的比率达到15.98±3.18，能够清晰勾勒肿瘤轮廓。用过量未标记的CE-21进行阻断实验，显著降低了肿瘤摄取量和肿瘤与背景的比率，证实了[⁶⁸Ga]Ga-CE-21的CEA特异性结合。

相比之下，[⁶⁸Ga]Ga-CE-88表现出较低的肿瘤摄取量和降低的肿瘤与背景对比度。[⁶⁸Ga]Ga-CE-88的肿瘤摄取量随时间推移而下降，60分钟时仅为1.56±0.04% ID/g，肿瘤与肌肉的比率低于2.5，表明肿瘤滞留有限。这种差异可能归因于结合位点屏障效应。CE-88更高的结合亲和力可能导致其滞留在肿瘤外围，限制了更深层组织的穿透。相反，CE-21相对适中的亲和力可能有助于更均匀的肿瘤分布，从而增强穿透性。除了卓越的穿透性，CE-21还表现出更有利的药代动力学特性，包括从血液和非靶组织中更快的清除速度。高效的肿瘤积累和快速的全身清除相结合，最终解释了CE-21优异的体内性能。

生物分布分析进一步证实了[⁶⁸Ga]Ga-CE-21与主要器官（包括肝脏、脾脏和心脏）相比，具有优先的肿瘤积累。肾脏清除被确定为主要排泄途径，这与PET/CT结果一致。值得注意的是，肝脏摄取较低，这对于成像腹部恶性肿瘤和检测结直肠癌常见的肝转移是一个有利特性。然而，与其他基于纳米抗体的示踪剂一致，[⁶⁸Ga]Ga-CE-21表现出较高的肾脏滞留，这可能会部分影响小腹部病变的成像。血液清除曲线显示快速清除半衰期为13.43分钟，表明全身清除效率高，辐射暴露风险降低。

[¹⁷⁷Lu]Lu-CE-21的体内抗肿瘤疗效评估

鉴于CE-21卓越的肿瘤靶向能力，研究人员用¹⁷⁷Lu对其进行标记，生成[¹⁷⁷Lu]Lu-CE-21，用于放射性同位素治疗(RIT)评估。放射化学产率为42.7±2.8%，通过放射性薄层色谱(Radio-TLC)测定放射化学纯度超过95%。经过质量控制后，LS174T异种移植瘤小鼠接受单次静脉注射7.4 MBq或18.5 MBq的[¹⁷⁷Lu]Lu-CE-21以评估疗效。

与生理盐水对照组相比，即使使用7.4 MBq剂量的[¹⁷⁷Lu]Lu-CE-21治疗也能显著延迟肿瘤生长，而18.5 MBq剂量则引起更强的抑制作用，显示出明显的剂量依赖性治疗效果。所有组别的小鼠体重保持稳定，表明耐受性良好。生存分析进一步证实了治疗益处：与对照组相比，18.5 MBq组的中位生存期显著延长（20.5天 vs. 13天）。值得注意的是，与传统的CEA预靶向放射免疫治疗(PRIT)不同，[¹⁷⁷Lu]Lu-CE-21通过单次注射即可实现有效的肿瘤靶向，简化了治疗方案并增强了其转化可行性。

为了研究作用机制，对肿瘤组织进行了γ-H2AX免疫组织化学染色。虽然在盐水处理的肿瘤中观察到可忽略的DNA损伤，但两个[¹⁷⁷Lu]Lu-CE-21治疗组均显示出显著的γ-H2AX阳性，其中18.5 MBq组的信号强度最高，表明诱导DNA双链断裂是肿瘤抑制的关键机制。

安全性评估显示，通过H&E（苏木精-伊红）染色，主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）未发现组织病理学异常。此外，血清生化参数，包括ALT（丙氨酸氨基转移酶）、AST（天门冬氨酸氨基转移酶）、BUN（血尿素氮）和肌酐，均保持在正常生理范围内，组间无显著差异。

健康志愿者中[⁶⁸Ga]Ga-CE-21的生物分布和剂量学

使用PET/CT成像进一步评估了[⁶⁸Ga]Ga-CE-21在健康志愿者中的体内生物分布。研究招募了三名健康志愿者，所有受试者对操作耐受良好，研究期间未出现不适、不良反应或生命体征和心电图记录异常。

成像显示主要积聚在肾脏、输尿管和膀胱，血池中有中度活性，非靶器官（包括脑、心脏、肺和肝脏）摄取较低。SUV_mean（平均标准化摄取值）和SUV_max（最大标准化摄取值）的定量分析证实了这些模式。与临床前模型中的积聚模式不同，人体中的肾脏活性随时间推移而降低，表明药代动力学快得多。这可能是因为肾脏在注射后15分钟第一次扫描前就达到了摄取峰值并进入快速清除期，这是一种常见的种属差异。总体分布表明具有快速的肾脏清除和最小的非特异性滞留，有利于在临床应用中实现高的肿瘤与背景对比度。

基于时间-活度曲线(TAC)的剂量学表明，肾脏是关键剂量限制器官，最高吸收剂量为4.11E-02±2.11E-03 mGy/MBq，这与肾脏排泄作为主要清除途径一致。估计的有效剂量为1.60E-02±5.51E-04 mSv/MBq，低于标准的[¹⁸F]FDG PET/CT，突出了其安全性特征。

本研究成功开发并表征了一种新型CEA特异性纳米抗体CE-21，其设计用于与成像和治疗性同位素进行位点特异性放射性标记。[⁶⁸Ga]Ga-CE-21在临床前结直肠癌模型和健康志愿者中均表现出卓越的成像性能，具有有利的生物分布、快速的药代动力学和可接受的辐射剂量特征。对[¹⁷⁷Lu]Lu-CE-21的补充研究证实了其强大的抗肿瘤功效和良好的安全性，突出了其作为靶向放射核素疗法的潜力。综上所述，这些结果确立了CE-21作为一种多功能诊疗一体化制剂，将精确的肿瘤可视化与有效的治疗干预相结合。通过结合高亲和力靶向、优化的标记化学和有利的体内特性，CE-21解决了传统基于抗体的示踪剂的关键局限性，并为结直肠癌及其他CEA表达恶性肿瘤的临床转化提供了一个有前景的平台。