靶向CAD的肿瘤微环境响应型纳米异质结协同诱导铜死亡并抑制结直肠癌进展

《Journal of Nanobiotechnology》：Targeting CAD with a tumor microenvironment-responsive nano-heterojunction for synergistic induction of cuproptosis and inhibition of colorectal cancer progression

本研究针对晚期结直肠癌(CRC)治疗中存在的靶向治疗耐药、肿瘤异质性及免疫治疗应答率低等难题，开发了一种靶向CAD（氨基甲酰磷酸合成酶II/天冬氨酸转氨甲酰酶/二氢乳清酶）的肿瘤微环境(TME)响应型镍铜纳米异质结(NCSH@siCAD&AVT-18A)。该纳米平台通过CD44介导的靶向递送，在酸性、高还原性TME中特异性释放siCAD、H2S供体AVT-18A和Cu+离子，实现CAD基因沉默、H2S增强的铜死亡(cuproptosis)和免疫调节的三重协同抗肿瘤效应。体内实验表明其在皮下、原位和转移性CRC模型中均表现出显著抑瘤效果且无系统毒性，为CRC治疗提供了新型联合治疗策略。

　　

在全球范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症相关死亡原因，其发病率在年轻人群中呈现上升趋势，已成为一个重大的全球健康问题。尽管早期CRC通过手术切除往往可以治愈，五年生存率超过90%，但超过一半的患者在确诊时已处于晚期阶段，治疗变得极具挑战性。晚期CRC的治疗主要依赖系统疗法，但存在明显局限性：标准化疗方案（如FOLFOX/FOLFIRI）伴随显著的脱靶毒性；靶向生物制剂（如贝伐珠单抗、西妥昔单抗）则受限于肿瘤异质性和获得性耐药；而免疫检查点抑制剂仅对少数具有高度微卫星不稳定性(MSI-H)的患者有效，大部分微卫星稳定(MSS)型CRC患者缺乏有效的免疫治疗选择。这些局限性凸显了开发新一代靶向疗法的迫切性。

纳米技术为这一难题提供了有前景的解决方案。纳米颗粒(Nanoparticles, NPs)凭借其独特的物理化学性质和可调控的结构，成为精准肿瘤学的理想工具。其尺寸（1-1000纳米）通过增强渗透和滞留(Enhanced Permeability and Retention, EPR)效应促进其在肿瘤组织的优先积聚。表面修饰（如透明质酸(Hyaluronic Acid, HA)，可结合CRC中过表达的CD44受体）可进一步增强被动靶向，实现受体介导的内吞作用，提高肿瘤特异性。然而，纳米药物的临床效用最终依赖于合适分子靶点的识别和验证。

当前针对CRC的分子靶向治疗面临持续的有效性障碍。KRAS在30-40%的病例中发生突变，但其蛋白质结构紧凑、构象稳定，结合口袋有限，难以被传统抑制剂靶向。虽然KRAS G12C抑制剂在特定小群体中显示出疗效，但其应用仍限于特定突变类型。同样，靶向EGFR受到补偿性反馈机制（包括HER2扩增、MET失调以及下游PI3K/AKT/mTOR通路突变）的限制，导致耐药性产生。对于BRAF V600E突变型CRC，抑制剂的反应通常是短暂的，因为MAPK通路会重新激活。这些局限性表明，针对单一通路的靶向策略存在不足，迫切需要寻找具有多功能调控作用的新型治疗靶点。

在此背景下，CAD（Carbamoyl-phosphate synthetase II/Aspartate transcarbamylase/Dihydroorotase，氨基甲酰磷酸合成酶II/天冬氨酸转氨甲酰酶/二氢乳清酶）作为一个有前景的治疗靶点浮现出来。与调控离散信号通路的传统靶点不同，CAD是一个多功能酶复合物，不仅主导嘧啶的从头合成，还通过非传统的代谢机制影响肿瘤生物学。先前的研究已暗示CAD在胶质母细胞瘤中维持干细胞特性和肿瘤发生，并通过β-连环蛋白(β-catenin)-AKT2-CAD轴促进肝癌发生。尽管CAD在其他恶性肿瘤中的致癌功能已被认识，但其在CRC中的作用尚不明确。本研究通过综合的生物信息学分析发现CAD在CRC组织中显著过表达，且高mRNA水平与患者较差的生存率相关。鉴于CAD在肿瘤进展中兼具代谢和非代谢作用，它成为一个具有重要诊断和治疗潜力的组织特异性生物标志物。

为开展研究，研究人员运用了多项关键技术方法。研究利用了生物信息学分析（TCGA、GEPIA、KM Plotter数据库）评估CAD的表达与预后。通过qRT-PCR、Western blot、免疫组织化学(IHC)在临床样本（34对CRC与癌旁组织，90对组织芯片）和细胞系中验证CAD表达。功能研究通过构建稳定敲低(shCAD)和过表达(OE-CAD)CAD的CRC细胞系，利用CCK-8、集落形成、EdU、Transwell迁移/侵袭、流式细胞术凋亡检测等进行体外验证。纳米材料NCSH NPs通过一锅法水热合成，并负载siCAD和AVT-18A，通过透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)、动态光散射(DLS)等进行表征。体外机制研究包括细胞摄取（共聚焦显微镜）、活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、ATP水平、线粒体膜电位(JC-1)、线粒体超微结构(TEM)及巨噬细胞极化（流式细胞术）等检测。体内疗效在Babl/c裸鼠的皮下、肺转移和原位CRC模型中评估，并通过活体成像、H&E染色、TUNEL、Ki-67和免疫荧光(IF)染色等分析肿瘤抑制、生物分布和安全性。

CAD在CRC中过表达并具有临床意义

生物信息学分析显示，与正常结肠组织相比，CAD转录本水平在CRC肿瘤组织中显著升高。Kaplan-Meier生存分析表明，较高的CAD表达与总生存期降低相关。对34对CRC及癌旁组织的qPCR分析证实肿瘤样本中CAD mRNA水平显著更高。组织微阵列(n=90对)的IHC染色及定量分析确认CRC组织中CAD蛋白表达升高。多变量Cox回归分析将高CAD表达确定为独立的预后因素。34对匹配组织的Western blotting也显示肿瘤中CAD蛋白水平显著增加。体外分析进一步支持这些结果，CRC细胞系显示出比正常结肠上皮细胞高得多的CAD表达。这些发现强调了CAD在CRC中的致癌潜力，将其上调与恶性程度增强和预后不良联系起来，从而支持其作为治疗靶点的候选资格。

验证CAD作为CRC纳米平台治疗的靶点

功能分析表明，CAD敲低显著降低了细胞增殖（集落形成和EdU掺入实验），而CAD过表达在DLD-1和HT29细胞中产生相反效果。Transwell迁移和Matrigel侵袭实验显示，CAD沉默后迁移和侵袭细胞数量显著减少。相反，CAD的过表达显著增加了细胞侵袭和迁移。凋亡实验显示，转染shRNA的HCT116和HCT8细胞凋亡率相对于对照组较低。相反，在HT29和DLD-1细胞中过表达CAD导致凋亡显著增加。Western blotting结果进一步验证，CAD敲低后抗凋亡标志物Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax表达增加。这些结果表明CAD通过促进细胞增殖、增强运动性和抑制凋亡，在CRC中作为多功能癌基因发挥作用。

体内实验评估CAD沉默的肿瘤抑制效果。来自CAD沉默细胞的肿瘤体积和重量显著减少，与对照组相比生长抑制高达70%。收获肿瘤的IHC染色显示较低的Ki67增殖指数和升高的cleaved caspase-3水平，表明凋亡活性增强，而CAD过表达引起相反效果。在肺转移模型中，注射CAD沉默的CRC细胞的小鼠肺结节减少了57%，同时Ki67和CAD蛋白表达降低，而CAD过表达导致相反效果。这些发现强化了CAD在体内促进CRC生长和转移的关键作用。

靶向纳米制剂的合成与表征

研究人员设计了一种基于镍铜硫化物的多功能纳米平台，用于共同递送siCAD和AVT-18A。该体系利用TME的酸性和氧化还原敏感条件，促进位点特异性基因沉默和硫化氢(H₂S)释放，以在CRC细胞中实现组合代谢破坏。表面功能化透明质酸能够通过CD44介导的内吞作用实现选择性摄取，从而提高肿瘤靶向准确性并最小化脱靶毒性。NCSH NPs通过Kirkendall扩散法使用CuCl、NiCl和透明质酸钠(NaHA)合成。表征证实了异质结的形成、成功的HA修饰以及AVT-18A和siCAD-2的有效负载。动态光散射(DLS)显示每个负载步骤后流体动力学直径增加。zeta电位逐渐降低证实了货物的顺序附着，氮吸附-脱附分析显示由于介孔通道占据导致表面积和孔体积减小。

纳米平台TME响应性和药物释放评估

该无机纳米复合材料为AVT-18A和siCAD提供了强大的抗酶降解保护，同时能在TME内实现精确释放。纳米平台表现出对酸性pH和高GSH水平的双重刺激敏感性。在模拟CRC微环境(pH 6.7)中，Ni²⁺和Cu²⁺离子的累积释放量在24小时内达到显著高于生理pH的水平。功能测试证实了H₂S的产生、Fenton样催化活性（由金属离子释放驱动）以及在pH 6.7下有效的GSH耗竭。这些结果证实pH触发的离子释放以及ROS/GSH通路破坏以时空可控的方式紧密协调。

细胞摄取和体外抗肿瘤机制的检查

CY7标记的纳米制剂在处理的细胞中显示出时间依赖性荧光增加，证实了有效的细胞质递送。CD44过表达的HCT116细胞与CD44缺陷的293T细胞之间的比较荧光成像揭示了HCT116中的选择性积累，验证了HA-CD44介导的摄取。功能测定显示，NCSH@siCAD&AVT-18A(VII)组表现出最大的增殖减少、最高的PI阳性细胞数、显著的线粒体膜去极化、升高的ROS、严重的线粒体损伤、最大的ATP耗竭和H₂S产生、最显著的GSH耗竭。Western blot分析显示铜死亡标志物DLAT和FDX1水平降低。处理细胞的免疫荧光(IF)显示脂酰化DLAT显著聚集。通过建立FDX1敲低细胞系，证实铜死亡是药物作用的主要机制。将RAW264.7巨噬细胞与纳米制剂共培养后，流式细胞术显示表达CD86的细胞百分比显著降低，而CD206阳性细胞比例显著升高，表明纳米材料诱导巨噬细胞向更抗炎的表型极化。这些观察结果证实纳米材料通过H₂S和铜离子释放诱导细胞内酸化和铜依赖性细胞死亡，同时抑制CAD表达并使巨噬细胞极化。

体内抗肿瘤活性和生物分布评估

在皮下异种移植瘤荷瘤小鼠中，CY7标记的纳米制剂在注射后12-24小时达到肿瘤荧光峰值，超过游离CY7。离体荧光分析证实纳米药物组呈现更高的肿瘤荧光水平。NCSH@siCAD&AVT-18A组显示出最强的抗肿瘤功效，在肿瘤重量和体积方面也有类似发现。IHC分析也表明NCSH@siCAD&AVT-18A组肿瘤坏死更广泛、Ki-67表达降低、cleaved caspase-3水平升高。通过收集健康小鼠注射后不同时间点的血液和器官样本，全面评估了化合物的体内安全性，显示良好的生物相容性。

原位CRC模型进一步验证了治疗效果：药物处理组II-VII显示出比PBS对照组更强的肿瘤抑制，其中VII组反应最显著。组织学评估(H&E染色)证实处理组肿瘤细胞坏死增加。安全性研究，包括主要器官评估和血清生化分析，未发现显著的组织损伤或生化异常，确认了优异的体内生物相容性。

本研究阐明了CAD在CRC中的致癌作用，并证明CAD过表达与不良临床结局相关。功能实验确定CAD抑制可抑制肿瘤生长、侵袭和转移，同时诱导凋亡。研究人员设计了一种镍铜硫化物纳米载体(NCSH NPs)，共同递送siCAD和AVT-18A，以TME响应方式触发铜死亡和凋亡。联合疗法在皮下和原位CRC模型中均显示出卓越的抗肿瘤功效。研究结果将CAD定位为CRC治疗的有前景靶点，并由此展示了NCSH NPs作为精准肿瘤学中一个多功能纳米平台的潜力。

这项研究的意义在于首次全面验证了CAD在CRC发病机制中的促瘤功能，并将CAD确立为一个关键的预后标志物和治疗靶点。更重要的是，它介绍了一种创新的协同治疗策略，通过一种肿瘤微环境响应型纳米平台，将CAD基因沉默与H₂S增强的铜死亡相结合。这种"基因-金属药物"模型通过协同表现遗传调控和金属相关效应克服单一疗法的局限性，为解决临床耐药提供了创新方案。TME响应平台实现的可控时空释放可显著降低脱靶毒性，推动精准医学。这是首次将金属离子调控与代谢重编程整合的方法，加深了对铜死亡的理解，并为"代谢-金属"双靶向治疗建立了理论框架。所靶向的途径对多种恶性肿瘤具有普适性，该平台技术可扩展至治疗难治性癌症，如肝癌和胰腺癌，显示出巨大的临床转化潜力。尽管存在诸如长期毒性评估、缺氧条件影响以及免疫调节功能验证等局限性需在未来研究中解决，但本研究无疑为CRC及其他实体瘤的治疗开辟了新的有效途径。