AI引导设计CXCR4靶向核壳纳米载体共递送小檗碱/紫杉醇用于癌症治疗

《Journal of Nanobiotechnology》：AI-guided design of a CXCR4-targeted core-shell nanocarrier for co-delivery of berberine/paclitaxel in cancer therapy

本研究针对结直肠癌治疗中药物协同性难以预测、靶向递送效率低等挑战，通过整合AI驱动的药物协同预测(MD-Syn)、肽配体发现(CABS-dock/NeuroSNAP-AI)和制剂优化三大模块，成功开发了CXCR4靶向的核壳纳米载体FMSN(BBR)-CXCR4BPL(PTX)。该载体通过介孔二氧化硅核(装载BBR)和脂质壳(装载PTX)的协同设计，实现了78.8%±1.9%(BBR)和75.2%±2.4%(PTX)的高载药量及72小时缓释特性。体内外实验表明，该体系可显著抑制CXCR4阳性CT26细胞的增殖迁移，并在小鼠模型中实现肿瘤消退(体积抑制率达85.4%)、逆转脾肿大，且无系统毒性，为AI指导的下一代肿瘤纳米药物开发提供了新范式。

　　

在癌症治疗领域，联合化疗通过同时使用多种作用机制的药物，已成为提高临床响应和延缓耐药性的重要策略。然而，如何从众多候选药物中快速识别真正具有协同效应的组合，并实现精准靶向递送，仍是当前面临的重大挑战。传统药物筛选方法耗时耗力，且纳米载体的设计往往依赖经验性尝试，缺乏系统性指导。针对这一难题，韩国中央大学和全南大学的研究团队在《Journal of Nanobiotechnology》发表了一项创新性研究，展示如何利用人工智能(AI)技术加速高效纳米药物的开发。

该研究聚焦于结直肠癌的治疗。结直肠癌中高表达的C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)与肿瘤转移和不良预后密切相关，是一个理想的靶点。研究人员设想，能否利用AI预测一对具有协同抗癌作用的药物，并设计一种能精准靶向CXCR4的纳米载体，将药物高效共递送至肿瘤部位？为此，他们开发了一套整合的三步AI工作流，并成功构建了一种名为FMSN(BBR)-CXCR4BPL(PTX)的智能纳米载体。

为开展本研究，作者团队运用了几项关键技术：首先，利用AI平台(MD-Syn)筛选与小檗碱(BBR)协同的FDA批准抗癌药；其次，结合CABS-dock和AlphaFold-multimer(通过NeuroSNAP-AI)计算筛选并验证高亲和力CXCR4靶向肽(CXCR4BP)；再者，通过溶胶-凝胶法制备磷酸盐/FITC(异硫氰酸荧光素)功能化的介孔二氧化硅纳米粒(FMSN)，并利用薄膜水化法构建载药的脂质体壳；此外，研究涉及了包括场发射透射电镜(FE-TEM)、能量色散X射线光谱(EDS)、动态光散射(DLS)等在内的纳米材料表征技术；最后，通过体外细胞实验(如CCK-8法、划痕实验)和体内CT26荷瘤小鼠模型，全面评估了纳米载体的靶向性、生物相容性及抗肿瘤功效。所有动物实验均遵循全南大学动物护理与使用委员会指南。

2. 结果与讨论

2.1. AI引导的CXCR4结合肽筛选与CXCR4BP-脂质体的制备

研究首先采用AI驱动流程筛选CXCR4的最佳配体。通过CABS-dock对SDF-1/CXCR4衍生序列进行柔性对接，筛选出一个9肽片段(KPVSLSYRC)。随后利用AlphaFold-multimer分析，其界面评分(ipTM)高达0.95，预测对齐误差(PAE)和预测距离误差(PDE)均显示高精度结合。该肽被命名为CXCR4结合肽(CXCR4BP)，并通过巯基-马来酰亚胺反应成功与DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺连接，偶联效率达97.2%±2%。以此制备的CXCR4BP-脂质体(CXCR4BPL)粒径约为122±4 nm，与对照无显著差异，但Zeta电位因肽的阳离子性从+12.3 mV变为+26.1 mV，BCA法证实每毫克脂质结合了112.6±6.2μg肽，验证了肽的成功修饰。

2.2. 磷酸盐/FITC功能化MSNs(FMSNs)的合成与理化表征

通过碱催化溶胶-凝胶法合成了MSNs，并共功能化3-三羟硅丙基甲基膦酸酯(THMP)和FITC-APTMS。X射线衍射(XRD)显示其保持了无定形二氧化硅框架。FE-TEM显示颗粒平均直径约150 nm，具有径向排列的介孔。STEM-EDS元素 mapping 和光谱证实了磷元素(6.52 wt%)的成功引入。傅里叶变换红外光谱(FTIR)在FMSN中发现了~1230 cm^-1处的P=O伸缩振动峰，证实了THMP的嫁接。FITC标记使颗粒具有明亮的绿色荧光，其强度与浓度呈线性关系。

0.9999 in every model(mean =0.999999852).(F) Size of FMSN, FMSN-CXCR4BPL, and CXCR4BPL by NTA.(G) Zeta potential of FMSN, FMSN-CXCR4BPL, and CXCR4BPL by DLS.(H)-(I) Stability testing of FMSN-CXCR4BPL for 7 days.(J) BBR and PTX encapsulation efficiencies in FMSN-CXCR4BPL.(K) Cumulative drug release profile over time. Data are mean ±SD.; n=4(A), n=5(E), n=3(F-J);p<0.01, and**p<0.0001.0001 vs. Control/Model. ns, not significant.(B) Scale bar= 100 nm.(C) Scale bar= 100 nm.(D) Scale bar=10μm.'>

2.3. FMSN上的CXCR4BPL包覆及FMSN-CXCR4BPL表征

通过探针超声促使带负电的FMSN与带正电的CXCR4BPL发生静电自组装，形成核壳结构。BCA assay检测到包覆后蛋白含量显著增加。FE-TEM结合STEM-EDS mapping 显示硅(Si)、磷(P)、碳(C)元素在FMSN-CXCR4BPL颗粒同一区域共定位。FE-SEM显示包覆后表面从光滑变得模糊，表明脂质层包覆。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)显示FITC-FMSN(绿色)与DiI标记的CXCR4BP(红色)信号共定位，证实了核壳结构。动态光散射(DLS)显示包覆后水合粒径(~130 nm)基本不变，Zeta电位从-7.3±1.5 mV变为+8.0±2.4 mV。纳米载体在PBS中7天内胶体稳定性良好。

2.4. 协同性筛选与BBR/PTX共载于FMSN-CXCR4BPL

利用Bliss独立性模型验证了AI预测的BBR与PTX协同作用，多个浓度组合显示出协同效应(如PTX 10μg/mL + BBR 1μg/mL, Δ=+30.1%)。经过一锅法自组装，最终纳米载体实现了BBR包封率(EE)78.8%±1.9%，PTX包封率75.2%±2.4%。基于投料比和实测包封率，理想化的制剂比例约为10:0.8:0.4(脂质:BBR:PTX, w/w)，体外实验有效药物浓度比例约为BBR:PTX = 2.5:1 (w/w)。体外释放实验表明，在PBS (pH 7.4, 37°C)中，BBR和PTX在72小时内均能持续释放。

2.5. FMSN-CXCR4BPL的体外生物相容性

通过活/死细胞染色和CCK-8法评估了空白FMSN和脂质包覆的FMSN-CXCR4BPL对CT26结肠癌细胞和人脂肪来源干细胞(hASC)的生物相容性。在100μg/mL高浓度下，裸露的FMSN导致细胞死亡增加(红色荧光)，而FMSN-CXCR4BPL处理组即使在高浓度下也几乎全是绿色活细胞信号。CCK-8结果一致：对于CT26细胞，100μg/mL裸露FMSN使活力降至74.6%±1.5%，而包覆后活力保持在93.9%±9.5%。hASC也呈现类似趋势。这表明脂质壳有效屏蔽了FMSN核心在高浓度下的潜在毒性，提高了生物相容性。

2.6. 体外和体内CXCR4介导的癌症靶向能力

通过CLSM和流式细胞术评估靶向性。CLSM显示，与裸露FMSN相比，FMSN-CXCR4BPL在CXCR4过表达的CT26细胞中内化更显著，孵育3小时后，纳米载体阳性细胞比例达18.9%±0.3%(FMSN-CXCR4BPL) vs 0.7%±0.1%(FMSN)。流式细胞术显示FMSN-CXCR4BPL组的平均荧光强度在3小时时高出3倍。在CT26荷瘤小鼠体内，静脉注射IR780染料标记的纳米载体后，活体成像显示FMSN-CXCR4BPL在肿瘤部位的荧光信号从24-48小时持续高于FMSN组。注射48小时后离体器官成像证实，FMSN-CXCR4BPL在肿瘤中的辐射效率是裸露FMSN的三倍。这些结果共同证明了CXCR4BPs显著增强了纳米载体在体外和体内的肿瘤靶向能力。

2.7. FMSN(BBR)-CXCR4BPL(PTX)的体外抗癌功效

在划痕实验中，载药靶向纳米载体FMSN(BBR)-CXCR4BPL(PTX)在24小时后能保留93.6%±2.9%的初始划痕面积，显著优于游离药物组合和非靶向载药颗粒，表明其能有效抑制CT26细胞迁移。CCK-8活力测定显示，孵育72小时后，靶向纳米载体处理组癌细胞活力降至36.2%±1.9%，而游离药物和非靶向颗粒组分别剩余81.1%±4.7%和68.9%±20.1%的活力。活/死细胞染色在72小时时仅在靶向纳米载体组观察到大量红色死细胞信号。这些结果验证了AI预测的BBR/PTX协同效应，并通过CXCR4靶向共递送，实现了更强的细胞毒性抗迁移效果。

2.8. FMSN(BBR)-CXCR4BPL(PTX)的体内抗肿瘤功效

在CT26荷瘤BALB/c小鼠模型中评估体内疗效。当肿瘤体积约100 mm3时，小鼠被分为PBS对照组、游离BBR、游离PTX、游离BBR/PTX组合、非靶向FMSN(BBR/PTX)和靶向FMSN(BBR)-CXCR4BPL(PTX)组，单次静脉给药(BBR等效剂量5 mg/kg)。结果显示，靶向纳米载体组肿瘤生长抑制最显著，第21天时肿瘤体积仅为PBS对照组的14.6%±4.8%，肿瘤重量也显著减轻(0.62±0.1 g vs 4.67±0.3 g)。所有组别小鼠体重无显著变化，表明系统耐受性良好。靶向治疗还显著逆转了肿瘤相关的脾肿大(脾重从876.2±68.9 mg降至214.3±55.1 mg)。免疫组化分析显示，靶向纳米载体组肿瘤组织Ki-67阳性细胞(增殖标记)降至对照的7.0%±5.2%，TUNEL阳性细胞(凋亡标记)增加6倍，CD31阳性区域(血管密度)减少至十分之一，表明其具有强大的抗增殖、促凋亡和抗血管生成作用。组织切片(H&E)未发现主要器官的病理损伤。

3. 结论

本研究通过串联三个正交的AI模块(MD-Syn药物协同预测、CABS-dock/AlphaFold-multimer肽配体发现、FormulationAI制剂优化)，成功构建了CXCR4靶向、共载BBR和PTX的核壳纳米载体FMSN(BBR)-CXCR4BPL(PTX)。该载体表现出高载药量、缓释特性、良好的生物相容性、优异的CXCR4介导的靶向能力以及AI预测的BBR/PTX协同抗肿瘤效果。在结直肠癌模型中，该载体能显著抑制肿瘤生长、逆转脾肿大、诱导凋亡、抑制增殖和血管生成，且无系统毒性。这项工作为AI加速下一代靶向联合纳米药物的开发提供了一个可推广的概念验证和通用蓝图，未来可适配于其他受体-配体轴和药物组合。