电穿孔与LNP递送H5N1血凝素DNA疫苗：针对高致病性禽流感的交叉保护与长效免疫研究

《npj Vaccines》：Electroporation and LNP-mediated delivery of plasmid DNA-encoded H5N1 influenza virus hemagglutinin support protection against highly pathogenic avian influenza

本文推荐：为应对高致病性禽流感H5N1（HPAI）的公共卫生威胁，研究者开发了基于电穿孔（EP）和脂质纳米颗粒（LNP）递送的质粒DNA疫苗，编码H5血凝素（HA）抗原。研究证实，匹配毒株（clade 2.3.4.4b）的DNA疫苗可诱导强效体液与细胞免疫，单剂LNP递送即可实现长达200天的持久保护，且多价疫苗策略可增强交叉保护。该研究为快速应对H5N1变异株提供了新型核酸疫苗平台支持。

　　

高致病性禽流感H5N1病毒（HPAI）持续对全球公共卫生构成严重威胁。近年来，H5N1病毒分支2.3.2.1c和2.3.4.4b导致的疫情频发，不仅造成家禽大量死亡，更引发了人类感染病例甚至死亡事件。更令人担忧的是，2024年该病毒首次在美国的奶牛中被发现，并持续在野生动物和家畜中传播。现有疫苗储备主要针对早期分支（如clade 1和2.1），但对当前流行株的防护效果有限。因此，开发能够快速应对新发病毒株的疫苗平台迫在眉睫。

在这项发表于《npj Vaccines》的研究中，Ebony N. Gary、Nicholas J. Tursi等研究人员探索了DNA疫苗平台在应对H5N1威胁中的潜力。他们设计了一种创新的策略：利用质粒DNA编码H5血凝素（HA）抗原，并通过两种先进技术进行递送——电穿孔（EP）和脂质纳米颗粒（LNP）。这种组合既保留了DNA疫苗的热稳定性和诱导细胞免疫的优势，又通过LNP递送增强了体液免疫应答。

研究团队重点关注了两个关键分支：2.3.2.1c（与柬埔寨人类感染病例相关）和2.3.4.4b（当前泛动物流行株）。他们对HA抗原进行了优化，包括修饰蛋白酶切割位点以增强安全性，并添加人IgE分泌信号序列以提高表达效率。通过系统的临床前研究，他们评估了这些DNA疫苗在小鼠模型中的免疫原性和保护效果。

关键技术方法包括：质粒DNA构建与优化（密码子优化、载体克隆）、电穿孔递送、LNP制剂制备、假病毒中和试验、酶联免疫斑点（ELISpot）、细胞内细胞因子染色、流式细胞术分析T细胞应答，以及在高生物安全等级实验室（加拿大公共卫生局）进行的H5N1活病毒攻毒实验。

质粒编码分支2.3.2.1c HA在小鼠中诱导强效体液反应

研究人员首先构建了编码分支2.3.2.1c HA的质粒DNA（pCamb）。免疫小鼠后，无论是单次还是加强免疫，均能诱导高水平的特异性结合抗体和假病毒中和抗体。然而，当针对异源性分支2.3.4.4b HA时，抗体反应显著降低，部分动物甚至无法检测到中和活性，提示抗原匹配对有效免疫至关重要。

分支2.3.2.1c HA DNA抗原对异源HPAI攻击提供部分保护

当用分支2.3.4.4b病毒攻击免疫小鼠时，pCamb免疫仅提供60%的保护率，且肺病毒载量降低有限。这表明尽管DNA疫苗能改善感染结果，但对完全保护而言，毒株匹配的抗原至关重要。

质粒编码分支2.3.2.1c HA在体内支持细胞应答

深入分析显示，pCamb免疫能激活多功能CD8⁺ T细胞（分泌IFN-γ和TNF-α）和CD4⁺ T细胞（三重细胞因子分泌）。淋巴结中CD40L⁺ T_FH细胞的增加也解释了疫苗诱导强效体液免疫的机制。

同源DNA免疫完全保护免受HPAI诱导的发病和死亡

为验证抗原匹配的重要性，研究人员用匹配的2.3.2.1c病毒攻击pCamb免疫小鼠。结果显示完全保护：无体重下降或死亡，肺病毒完全清除，证实同源免疫的优势。

分支2.3.4.4b在结构上不同于储备疫苗分支

通过AlphaFold 3建模，团队可视化展示了当前流行株与储备疫苗株（clade 1、2.1）在HA头区（含受体结合位点）的显著差异，这解释了为何传统疫苗对2.3.4.4b病毒效果有限。

分支2.3.4.4b H5 HA的DNA递送支持强效细胞和体液反应

新构建的分支2.3.4.4b HA质粒（pMich）免疫小鼠后，诱导了分支特异性的结合和中和抗体。当pCamb和pMich联合免疫时，血清对两个分支均产生高滴度抗体，且攻毒实验显示完全保护，突显多价策略的潜力。

DNA的LNP递送支持强效、持久且保护性的抗H5免疫

将pMich封装于LNP后，单剂免疫即可在200天内维持高抗体水平。急性期（21天）和记忆期（>200天）攻毒均实现完全保护，肺病毒载量显著降低，证明LNP递送的DNA疫苗具有剂量节约和长效防护特点。

本研究强调，针对高致病性禽流感H5N1，抗原匹配是疫苗有效的关键。DNA平台兼具设计灵活、热稳定、易量产优势，特别适合应对快速变异的病毒威胁。多价配方可拓宽保护范围，而LNP递送则能增强免疫原性并实现长效保护。这些发现为开发针对新发H5N1毒株的快速应对疫苗提供了有力支持，不仅适用于人类防疫，也可能在畜禽养殖业中发挥重要作用，从而从源头上控制病毒传播。该DNA-LNP平台的成功验证，为未来应对其它新发传染病提供了重要技术储备。