羊巴贝斯虫SBP4蛋白的分子特性与重组表达：一种潜在的血清诊断抗原

《Scientific Reports》：Molecular characterization and recombinant expression of Babesia ovis SBP4 protein as a potential serodiagnostic antigen

本研究针对羊巴贝斯虫病缺乏有效血清诊断标志物的问题，通过分子克隆与重组表达技术成功获得巴贝斯虫球形蛋白4（SBP4），证实其能被自然感染绵羊血清特异性识别，并成功诱导兔体产生高效价抗体，为开发新型血清学诊断方法奠定了重要基础。

　　

在蜱虫猖獗的牧场上，一种名为羊巴贝斯虫病的寄生虫病正悄然威胁着绵羊的健康。这种由巴贝斯虫（Babesia ovis）引起的血液原虫病，广泛分布于南欧、中东和亚洲的地方性流行区域，给畜牧业带来显著经济损失。受感染的羊只会出现高热、贫血、黄疸乃至血红蛋白尿等严重症状，其病原体主要通过璃眼蜱属（Rhipicephalus bursa）的叮咬进行传播。

尽管该病具有重要的临床意义，但长期以来，准确诊断羊巴贝斯虫病却面临挑战。现有的血清学诊断方法缺乏高效特异的抗原标志物，这制约了疫情监测和防控效果。在巴贝斯虫家族中，球形蛋白（Spherical Body Proteins, SBPs）是一类在虫体入侵红细胞过程中起关键作用的分泌蛋白。其中，球形蛋白4（SBP4）在牛巴贝斯虫（B. bovis）和双芽巴贝斯虫（B. bigemina）中已被证实是高度免疫原性的诊断抗原。然而，在羊巴贝斯虫中，SBP4蛋白的特性及其诊断价值却完全是未知领域。

为填补这一空白，由Sezayi Ozubek和Munir Aktas领导的研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果。他们首次对羊巴贝斯虫SBP4（BoSBP4）进行了全面的分子特征分析和重组表达研究，并评估了其作为血清诊断抗原的潜力。这项开创性工作为开发新一代羊巴贝斯虫病诊断试剂盒提供了重要的候选抗原。

研究团队运用了多种关键技术方法：通过生物信息学分析预测蛋白特性；利用PCR技术从土耳其八个省份的野外分离株中扩增sbp4基因；将密码子优化后的基因克隆至pET-29b(+)载体，在大肠杆菌C43(DE3)中表达可溶性重组蛋白；通过镍柱亲和层析纯化蛋白；使用Western blot和间接ELISA评估重组蛋白与自然感染绵羊血清的免疫反应性；并通过兔体免疫实验验证蛋白的免疫原性。

结果

SBP4蛋白的生物信息学特征

研究人员从羊巴贝斯虫Selcuk分离株基因组中鉴定了sbp4基因。该基因长度为984 bp，不含内含子，编码327个氨基酸的蛋白质。生物信息学预测显示，该蛋白具有N端信号肽，无跨膜结构域，提示其为分泌性可溶性蛋白。同线性分析表明，sbp4基因在巴贝斯虫属中具有保守的基因组环境。氨基酸序列比对显示，羊巴贝斯虫SBP4与东方巴贝斯虫（B. orientalis）相似性最高（44.6%），与其他巴贝斯虫物种相似性在31.9%-44.6%之间。

sbp4基因的PCR扩增

研究成功设计了特异性引物，从羊巴贝斯虫Alacakaya稳定株及土耳其八个省份的野外分离株中均扩增出完整的sbp4基因。序列分析显示，所有分离株的SBP4氨基酸序列高度保守，仅在C末端第325位存在一个氨基酸替换，表明该蛋白在不同地理来源的菌株中稳定性良好。

重组rBoSBP4蛋白的表达与纯化

研究人员将密码子优化后的sbp4基因（去除信号肽序列）克隆至pET-29b(+)载体，并在大肠杆菌C43(DE3)中成功表达。优化表达条件为：OD₆₀₀=0.7时加入0.5-1 mM IPTG，18°C诱导过夜。表达的重组蛋白分子量约为37 kDa，主要以可溶性形式存在，并通过镍柱亲和层析高效纯化。Western blot使用抗His抗体验证了蛋白的表达。

自然感染血清的Western blot和间接ELISA分析

Western blot分析显示，纯化的rBoSBP4能被自然感染羊巴贝斯虫的绵羊血清特异性识别，在约37 kDa处出现单一清晰条带，而阴性对照血清无任何反应。间接ELISA结果进一步证实，自然感染血清与rBoSBP4具有强免疫反应性，阳性血清的光密度值显著高于阴性对照。

兔体免疫与多克隆抗体应答

为评估rBoSBP4的免疫原性，研究人员用纯化蛋白免疫新西兰白兔。间接ELISA检测显示，免疫后血清中特异性抗体水平显著升高，表明rBoSBP4能有效诱导兔体产生强烈的抗体应答。

讨论与结论

本研究首次系统阐述了羊巴贝斯虫SBP4的分子和免疫学特征。研究结果表明，rBoSBP4具有良好的免疫原性和抗原特异性，能被自然感染宿主的抗体识别，在实验动物中也能诱导强烈的体液免疫应答。序列分析显示该蛋白在不同地理分离株中高度保守，支持其作为广谱诊断抗原的潜力。

然而，研究也存在一定局限性：缺乏使用兔免疫血清的Western blot验证；使用的自然感染血清均为急性感染后样本，尚不清楚SBP4特异性抗体在感染早期或慢性期的反应动态；未评估与其他巴贝斯虫物种的交叉反应性。此外，目前仅评估了体液免疫应答，细胞免疫应答和蛋白的保护性免疫效果仍有待研究。

综上所述，羊巴贝斯虫SBP4蛋白展现出作为新型血清诊断抗原的巨大潜力。其高度保守性和强免疫原性为开发高效、特异的羊巴贝斯虫病诊断方法奠定了坚实基础。未来研究需进一步评估该抗原在实验感染动物中的抗体动态变化，并验证其诊断特异性，以推动其在实际防控中的应用。同时，SBP4也可能成为疫苗研发的候选抗原，为羊巴贝斯虫病的综合防控提供新策略。