单侧输尿管梗阻诱导肾纤维化前骨盆尿中胶原降解减少的早期预警作用

《Scientific Reports》：Reduced collagen degradation in pelvic urine precedes kidney fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction

本研究针对肾纤维化发展中胶原降解作用不明的关键问题，通过分析单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型骨盆尿中胶原衍生肽(CDPs)组成，发现纤维化形成前(术后3天)即有70%的CDPs显著减少，提示胶原降解减弱是肾纤维化的早期事件。该研究为抗纤维化策略提供了新靶点，相关成果发表于《Scientific Reports》。

　　

慢性肾脏病(CKD)是全球性的健康挑战，其典型病理特征——肾纤维化，如同器官上的"疤痕"，最终会导致肾功能逐渐丧失。尽管医学界对纤维化过程中胶原过度合成的机制已有较多研究，但关于胶原降解过程在纤维化发展中的作用却始终笼罩在迷雾之中。胶原降解的平衡决定了组织中胶原的净积累量，这一过程的异常可能是纤维化形成的关键环节。

在胶原降解过程中，内切蛋白酶和外肽酶共同作用，产生一系列胶原衍生肽(CDPs)。理论上，这些肽段的产量应与胶原积累量呈负相关。虽然先前研究发现尿液中某些前胶原片段与纤维化相关，但内部CDPs作为胶原降解的潜在生物标志物，其与肾纤维化的直接关联尚未得到明确证实。

为了解决这一科学问题，由Teresa Frattini领衔的国际研究团队在《Scientific Reports》上发表了创新性研究。他们采用单侧输尿管梗阻(UUO)这一经典小鼠模型，该模型能快速诱导肾纤维化，且具有独特优势：梗阻侧肾脏产生的尿液积聚在骨盆内，直接与纤维化组织接触；而对侧健康肾脏则继续产生膀胱尿液。这种设计使研究人员能够分别分析来自纤维化肾脏和非纤维化肾脏的尿液成分，从而精确研究CDPs与纤维化的关系。

研究团队发现，UUO手术后3天，虽然胶原基因(Col1a1和Col3a1)的mRNA水平已显著升高，但肾脏中尚未检测到明显的胶原蛋白沉积增加。直到术后7天，胶原蛋白沉积才显著增加，表明纤维化已经完全形成。这一发现为研究纤维化早期事件提供了关键时间窗口。

通过毛细管电泳-质谱(CE-MS)技术，研究人员对尿液肽段组进行了全面分析。结果显示，CDPs是尿液中最丰富的肽段类别，占总检测肽段数量的58%和总丰度的66%。其中，Col1a1、Col1a2和Col3a1来源的CDPs最为丰富。有趣的是，这些CDPs沿着亲本蛋白序列呈簇状分布，每个簇包含长度递减的肽段，最短的肽段作为"锚定序列"被包含在所有较长肽段中。这种分布模式提示CDPs可能是通过逐步降解产生的。

最关键的发现在于：UUO术后3天，当肾脏尚未出现明显纤维化时，骨盆尿液中已有300种CDPs发生显著变化，其中70%显示丰度降低。与此形成鲜明对比的是，非CDPs肽段中只有22.9%显示减少。这种变化具有特异性，因为一些非CDPs肽段(如Kap、Mup等)在骨盆尿液中反而增加。

骨盆尿液与膀胱尿液表现出截然不同的CDPs变化模式。7天UUO后，膀胱尿液中只有18.7%的CDPs减少，而骨盆尿液中这一比例高达69.7%。相关性分析进一步显示，骨盆和膀胱尿液中Col1a1-DPs簇内各肽段间的丰度相关性存在显著差异，表明两者涉及不同的蛋白酶调控机制。

研究采用的主要技术方法包括：建立小鼠UUO模型并分别收集骨盆和膀胱尿液；通过天狼星红染色和免疫组织化学分析肾脏胶原沉积；运用毛细管电泳耦合质谱(CE-MS)技术进行尿液肽段组分析；采用CE-MS/MS进行肽段测序；使用Proteasix工具预测蛋白酶切割位点；通过统计学方法鉴定差异表达肽段并进行相关性分析。

Kinetics of kidney fibrosis development

研究发现UUO术后3天，Col1a1和Col3a1的mRNA水平已显著升高，但皮质间质胶原蛋白含量尚未明显增加。直到术后7天，胶原蛋白沉积才显著增加，表明纤维化形成。这表明胶原基因表达上调先于实际的蛋白沉积。

CDPs are the most abundant peptide species in urine

质谱分析鉴定出1508种测序肽段，其中CDPs在数量和丰度上均占优势(58%和66%)。Col1a1、Col1a2和Col3a1来源的CDPs最为丰富。这些CDPs沿亲本蛋白序列呈簇状分布，覆盖率达46.0%、39.8%和52.3%，提示它们是通过逐步降解产生的。

Pelvic urinary CDP abundance is decreased before detectable kidney fibrosis

与假手术组膀胱尿液相比，UUO术后3天的骨盆尿液中472种肽段发生显著变化，其中近2/3为CDPs，且69.7%显示丰度降低。而非CDPs中只有22.9%减少，表明CDPs的减少具有特异性。

CDP down-regulation is specifically associated to the obstructed fibrotic kidney

膀胱尿液的变化与骨盆尿液截然不同：术后3天无明显变化，术后7天虽有236种肽段变化，但只有18.7%的CDPs减少。CDPs沿亲本蛋白序列的调控模式在骨盆和膀胱尿液间呈"镜像"关系，表明蛋白酶活性受到相反调控。

Generation of urinary Collal-derived peptides strongly differs between fibrotic and contralateral kidney

相关性分析显示，骨盆和膀胱尿液中Col1a1-DPs簇内各肽段间的丰度相关性差异显著，仅2个相关性共同存在，进一步证实两者涉及不同的肽段生成机制。

研究表明，胶原降解减少在肾纤维化发展早期即发挥重要作用。骨盆尿液中CDPs的减少先于可检测的胶原沉积增加，表明受损的胶原降解是纤维化形成的早期事件。这一发现挑战了传统观点，将研究焦点从单纯的胶原合成扩展至合成与降解的平衡调控。

研究的创新性在于直接分析了纤维化肾脏来源的骨盆尿液，避免了膀胱尿液中其他来源肽段的干扰。CDPs簇状分布的特征为理解胶原降解机制提供了新视角，提示外肽酶在生成最终尿CDPs中起关键作用。

该研究的临床意义在于：骨盆尿液CDPs分析可能作为评估肾纤维化的新方法；增强胶原降解或许成为抗纤维化治疗的新策略。未来研究可探索是否通过调控特定蛋白酶活性能够延缓或逆转纤维化进程。

尽管存在无法获取假手术组骨盆尿液等技术限制，但本研究首次提供了胶原降解减少参与肾纤维化早期发展的直接证据，为理解纤维化机制和开发新的治疗策略奠定了重要基础。