综述：追求超灵敏磷酸化蛋白质组学以揭示稀有细胞中的信号传导

《Communications Biology》：The pursuit of ultrasensitive phosphoproteomics to unravel signalling in rare cells

本综述系统阐述了低起始样本磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）的最新进展，重点关注如何克服稀有细胞样本量不足的挑战。文章深入探讨了细胞分离技术（如FACS、LCM）、样本制备（如SP3、iST）、多重标记（如TMT）、磷酸化肽段富集（如IMAC、MOAC）以及高灵敏度质谱采集策略（如DDA、DIA）等关键环节的优化与创新，为在发育生物学、疾病机制（如癌症、耐药性）等研究中解析稀有细胞群体的信号网络提供了全面的方法学指南。

　　

细胞异质性是所有组织的固有特性，这种表型多样性是生物系统正常功能的基础，也是许多疾病功能失调的起源。理解细胞多样性背后的机制研究长期以来依赖于DNA和RNA测序技术，这些技术能够扩增遗传物质，在研究低频率出现的细胞群体时具有显著优势。然而，蛋白质组学能够直接测量蛋白质丰度及其翻译后修饰（PTMs），为细胞过程提供了更准确的反映。在调控细胞行为的信号网络中，由激酶和磷酸酶执行的磷酸化事件触发了下游信号级联反应。因此，磷酸化蛋白质组学对于提供信号动态的快照至关重要。

细胞分离

研究特定细胞群体的第一步是从异质性样本中将其分离出来。激光捕获显微切割（LCM）和荧光激活细胞分选（FACS）是最常用的单细胞分离方法。磁激活细胞分选（MACS）是FACS和LCM的替代方案，提供基于抗体的细胞群体快速富集。这些技术各有优缺点，选择取决于样本复杂性和所需的精度水平。

LCM允许从组织切片中精确分离单个细胞或小簇，是保留组织内空间信息的理想选择。将LCM与LC-MS/MS联用已有多项报道，使得对固定组织中的低细胞数甚至单细胞进行无偏超灵敏空间蛋白质组学分析成为可能。

FACS利用荧光标记和流式细胞术，基于形态学参数以及细胞外和细胞内蛋白的表达来分离细胞。它因其高特异性、低技术要求和通量而被广泛用于活细胞分离。然而，将FACS与低输入磷酸化蛋白质组学整合面临挑战。分选过程中细胞悬浮在鞘液（通常是PBS）中，去除该缓冲液可能导致样本损失，而直接在缓冲液中处理样本则会因反应动力学差而影响裂解和消化效率。此外，分选过程本身可能扰动磷酸化蛋白质组，尤其是在急性刺激信号实验中。

样本裂解与消化

为磷酸化蛋白质组学制备分离的细胞需要多步处理，从蛋白质提取和消化开始。最大化蛋白质回收率对于起始材料已经有限的低输入样本尤为重要。优化细胞裂解和蛋白质消化以防止过多样本损失，可以显著提高数据采集的质量和稳健性。

传统的基于去垢剂或离液剂的裂解缓冲液广泛应用于自下而上的蛋白质组学，但将其应用于FACS兼容的低输入工作流程并非易事。单细胞蛋白质组学领域已广泛放弃传统的去垢剂和离液剂变性剂，转而采用水基缓冲液结合冻融循环诱导低渗裂解。这些方法已被证明在单细胞和载体样本制备（数百或数千个细胞）中取得成功。除了水裂解，十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）等表面活性剂也被用于提高肽段回收率，其主要益处在于减轻肽段和蛋白质对塑料和玻璃的吸附，而非提高裂解效率。

这些来自单细胞和低输入蛋白质组学的见解突显了向小型化、集成化裂解-消化工作流程的转变，减少了损失并提高了灵敏度。将这些简化的方法应用于低输入磷酸化蛋白质组学，将是从有限样本中获得可重复、深度覆盖的关键。

标记

标记方法能够实现多重分析，与顺序分析单个样本相比具有多个优势。它可以提高通量、数据完整性和工作流程一致性。也许最重要的是，多重分析减少了标记后样本制备步骤相关的技术变异性，这在研究动态修饰（如磷酸化）时尤为重要。

标记方法可以在细胞、蛋白质或肽段水平上进行。最常见的方大致可分为同量异位和非同量异位标记。同量异位方法包括串联质量标签（TMT）和同量异位标签相对和绝对定量（iTRAQ），而非同量异位方法包括细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）、质量差异标签和绝对定量（mTRAQ）以及二甲基标记。

TMT通常是低输入磷酸化蛋白质组学的首选方法，因为它具有更高的多重分析能力、适用于广泛的生物样本，并且与其他标记技术相比提高了定量精度。多重分析还允许引入额外的“载体”通道来增强MS1信号，从而触发后续的MS2分析。然而，同量异位标记可能受到比率压缩的影响，这是由共碎片和共洗脱肽段污染报告离子信号引起的。使用载体通道可能加剧此问题。

标准的TMT标记方案通常需要25-100微克输入材料，并且通常在溶液中进行。这种样本制备形式与低输入样本不兼容，因为低底物浓度会导致标记效率降低。在柱上而非在溶液中进行TMT标记，可增强反应动力学并减少低输入样本的样本损失。柱上标记有潜力通过结合标记与脱盐来简化低输入样本制备工作流程，以限制样本损失并浓缩肽段。

磷酸化肽段富集

磷酸化富集可以在蛋白质水平进行，但更常见的是在肽段水平进行，因为磷酸化肽段具有更简单的化学性质和结构，使其更容易分离。目前最流行的富集方法依赖于基于亲和力的色谱法，例如固定化金属离子亲和色谱（IMAC）或金属氧化物亲和色谱（MOAC）。这两种方法都利用金属离子或金属氧化物以高特异性和亲和力与磷酸基团相互作用的能力。

使用这些富集材料的磷酸化蛋白质组学方案通常针对数百微克的起始材料进行了优化，不适用于低细胞数。最近的工作旨在解决与高体积、低反应效率以及结合选择性和特异性相关的问题。除了小型化，自动化磷酸化肽段富集已被证明可以提高重现性并最小化损失。此外，在脱盐步骤中通过冷却色谱柱来控制温度，显著改善了对亲水性磷酸化肽段的保留。

虽然很明显多重分析是低输入磷酸化蛋白质组学的一个有前途的选择，但目前尚不清楚应如何将标记与磷酸化肽段富集结合起来以获得最佳结果。一些研究在分选的细胞进行TMT标记后进行IMAC磷酸化富集，而另一些研究则先进行磷酸化富集，然后进行TMT标记。这些研究突出了磷酸化富集技术的进步，使得能够分析纳米级样本。

样本分离与分级分离

多维分离技术已被开发用于解决蛋白质组样本的高复杂性和动态范围以及需要测量低丰度分析物的挑战。虽然反相液相色谱与质谱联用已被普遍使用，但额外的正交分离方法可以显著改善肽段分离，从而增加采样的蛋白质组深度。

对于高输入样本，额外分级分离技术的好处是显而易见的，但对于低输入样本，由于谱图复杂性降低，额外处理步骤相关的肽段分离、峰高和样本损失之间的权衡就不那么明显了。一些研究对可用的分级分离技术进行了比较，为低输入磷酸化蛋白质组学样本的最佳策略提供了宝贵的见解。

为了减少分析时间并提高通量，单细胞蛋白质组学领域的许多先驱团体选择使用在线气相分级分离方法（例如，高场不对称波形离子迁移谱FAIMS， trapped ion mobility spectrometry TIMS），而不是离线液相分级分离或串联色谱技术。基于离子迁移率的选择性离子过滤能够更好地分离异构体和密切相关的物种，从而提高信噪比，允许检测低丰度蛋白质，这对于低输入样本尤为重要。

质谱采集

自下而上的发现蛋白质组学的两种数据采集方法是数据非依赖采集（DIA）和数据依赖采集（DDA）。DDA基于实时丰度选择前体离子，通常选择强度最高的离子进行碎裂，而DIA同时碎裂预定义质量范围内的所有前体离子。

在磷酸化蛋白质组学的背景下，采集策略不仅影响肽段鉴定和定量的深度与准确性，还影响将磷酸化修饰定位到特定残基的可信度。同量异位标记方法依赖于基于MSn的定量，这意味着它们只能与DDA结合使用，因为DIA期间执行的前体碎裂是非选择性的。目前DIA和同量异位标记的不兼容性意味着在设计低输入磷酸化蛋白质组学实验时需要权衡利弊。同量异位标记的优势在于通过多重分析增加每次进样的总细胞数，从而提高了通量并为磷酸化肽段富集提供了更多的起始材料。相反，DIA可以克服与DDA相关的随机性限制，从而提高灵敏度和覆盖度。

最近发表的用于单细胞蛋白质组学的LFQ-DIA方法突显了DIA用于低输入蛋白质组学的可能性。重要的是，这些研究展示了无文库DIA方法的能力，这对于低细胞数分析是必要的，因为生成谱图库的样本可用性有限。DIA已在高输入磷酸化蛋白质组学和单细胞蛋白质组学中实现了肽段鉴定数量的显著增长。最近，LFQ-DIA已被应用于低微克级磷酸化蛋白质组学。

缺失值的普遍存在是低输入蛋白质组学的一个主要挑战。这部分是由于鸟枪法DDA方法的MS2选择标准，它优先处理高丰度前体离子，导致跨样本测序不同的前体，从而产生缺失值。这可以通过DIA在很大程度上克服，对于同一多重分析中的样本，TMT也在一定程度上可以克服。其他技术也在涌现以解决此问题，例如MaxQuant.Live和Hybrid-DIA等混合方法，它们整合了靶向和发现策略，可以改善已知信号通路的覆盖度。考虑到PTMs的高动态范围以及随机和瞬时性质，这些方法在低输入磷酸化蛋白质组学的背景下可能更具优势。

总结

本综述重点介绍了低输入磷酸化蛋白质组学样本制备和分析快速发展的前景。尽管最近的发展导致了高效标记和多重分析、磷酸化肽段富集、分级分离和高灵敏度MS采集的方法，但这些工作流程被用于解决有趣生物学问题的例子仍然有限。这是由于与现有细胞分离技术整合不足，这对传统的磷酸化蛋白质组学样本制备方案提出了实际挑战。

现有证据表明固相TMT标记前景广阔。这种方法通过减少过度标记率、减少所需TMT试剂量以及通过将脱盐与标记相结合来简化整体工作流程，在低输入和高输入样本中均优于溶液内标记。对于少于1微克的样本，与单次DIA相比，多重分析似乎仍然有利。相反，超过1微克的样本可能会受益于DIA方法，具体取决于样本制备工作流程的稳健性和通量能力。

超灵敏低输入磷酸化蛋白质组学方法的发展对于解决细胞数量有限的复杂生物学问题至关重要。这个问题在发育和干细胞生物学、疾病起源和进化以及涉及模式生物的研究领域尤为突出，这些领域中的特定细胞类型可用量很低。在这些背景下利用磷酸化蛋白质组学技术，将提供以前用下一代测序技术无法实现的细胞信号传导新见解。展望未来，进一步的进展将依赖于在单细胞蛋白质组学取得的快速进展基础上，特别是在小型化和自动化方面，以简化磷酸化蛋白质组学工作流程。改进与细胞分离技术的整合并在生物学相关模型中进行验证，将是将这些技术进步转化为有影响力发现的关键，从而实现对原代组织样本和稀有细胞群体中信号传导的更深入 mapping。