基于工程益生菌的口服疫苗黏膜递送系统实现基因编码双抗原阵列及其抗肿瘤免疫疗效

《Nature Communications》：Probiotic-based oral vaccine mucosal delivery system enabling genetically encoded dual-antigen arrays

本研究针对口服肿瘤疫苗面临的胃肠道稳定性差、抗原递送效率低等挑战，开发了一种工程化益生菌口服疫苗系统BacOR-Fn-T+phiX174。该系统通过阿拉伯糖诱导的细菌裂解释放携带OVA/TRP2双抗原的铁蛋白纳米颗粒，经M细胞靶向穿越肠屏障，有效激活黏膜树突状细胞，在黑色素瘤肺转移和皮下模型中均展示显著治疗效果，并建立持久免疫记忆，为新一代无针癌症疫苗开发提供新策略。

　　

癌症免疫治疗领域近年来取得显著进展，但传统注射疫苗存在依从性差、局部不良反应等局限。口服疫苗因其非侵入性和诱导全身-黏膜双重免疫应答的独特优势备受关注，然而蛋白质抗原在胃肠道易被降解、肠上皮穿透效率低等问题严重制约其发展。如何实现抗原的胃肠道稳定递送和高效免疫激活，成为口服肿瘤疫苗研发的关键瓶颈。

针对这一挑战，郑州大学闫汐韵、蒋冰团队在《Nature Communications》发表创新性研究，开发出基于工程益生菌的口服疫苗黏膜递送系统。该系统巧妙整合了合成生物学与纳米疫苗设计理念，通过基因编码技术在铁蛋白（ferritin）纳米颗粒上精准展示OVA（卵清蛋白）和TRP2（酪氨酸酶相关蛋白2）双抗原，并引入阿拉伯糖诱导的细菌裂解机制，实现肠道内可控抗原释放。

研究人员采用多学科交叉技术方法开展研究：通过分子克隆构建表达不同抗原组合的工程菌株；利用透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）表征纳米颗粒理化性质；建立体外M细胞共培养模型和结肠环实验评估抗原转运效率；运用B16-F10-OVA黑色素瘤的肺转移和皮下移植瘤模型评价治疗效果；通过流式细胞术、ELISpot（酶联免疫斑点法）等技术全面分析免疫应答；并利用16S rRNA测序进行肠道菌群安全性评估。

Construction and characterization of the Bac^{OR-Fn-T+phiX174} oral vaccine system

研究成功构建了四种工程菌株，其中Bac^{OR-Fn-T+phiX174}（G4）可表达同时展示OVA257-264（CD8⁺ T细胞表位）、OVA323-339（B细胞表位）、RGD靶向肽和TRP2_180-188（CD8⁺ T细胞表位）的双抗原铁蛋白纳米颗粒。蛋白质印迹（Western blot）和SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）验证了目的蛋白的正确表达，尺寸排阻色谱和透射电镜显示纯化的铁蛋白呈均匀球形，流体动力学直径约16纳米。

Inducible bacterial lysis and intestinal distribution of Bac^{OR-Fn-T+phiX174}

阿拉伯糖诱导实验表明，99%以上的工程菌在8小时内裂解，抗原释放与裂解动力学同步。在模拟胃肠液环境中，细菌在模拟肠液（SIF）中仍保持阿拉伯糖诱导裂解能力，而在模拟胃液（SGF）中因强酸抑制代谢而不发生裂解。体内分布追踪显示，口服的工程菌可定植于结肠区域，并在6小时内快速清除，避免了长期滞留风险。凝胶渗透色谱（GPC）证实结肠内容物中可检测到完整释放的OR-Fn-T抗原。

Bac^{OR-Fn-T+phiX174} delivers OR-Fn-T across the intestinal barrier and activates mucosal dendritic cells

体外M细胞共培养模型表明，RGD修饰的铁蛋白（OR-Fn-T）穿越肠上皮屏障的效率显著提高，并有效激活基底侧树突状细胞（约40%细胞表达成熟标志CD86）。结肠环实验进一步验证了RGD介导的黏膜穿透增强作用。流式细胞术分析显示，OR-Fn-T直接刺激树突状细胞成熟的效果最佳，且该作用依赖于抗原价态而非RGD靶向。

Therapeutic effects of Bac^{OR-Fn-T+phiX174} in a lung metastatic melanoma model

在B16-F10-OVA黑色素瘤肺转移模型中，Bac^{OR-Fn-T+phiX174}治疗显著减少肺部转移结节。免疫分析显示，该治疗组小鼠脾脏中CD8⁺ T细胞、IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞、OVA_257-264-H2Kb四聚体⁺ T细胞比例显著升高，同时调节性T细胞（Treg）比例下降。ELISpot检测发现脾细胞经OVA/TRP2肽重刺激后IFN-γ分泌增加，血清中抗原特异性IgG滴度升高，肺转移灶内CD8⁺ T细胞和CD19⁺ B细胞浸润增强。

Antitumor efficacy of Bac^{OR-Fn-T+phiX174} oral vaccine in a subcutaneous melanoma model

在皮下移植瘤模型中，双抗原口服疫苗抑瘤效果与Poly(I:C)佐剂肽疫苗相当，显著延缓肿瘤生长。肿瘤组织内CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、CD19⁺ B细胞和成熟树突状细胞浸润增加，结肠黏膜中亦观察到CD19⁺ B细胞和CD3⁺ T细胞聚集，表明同时激活了系统性和黏膜免疫应答。

Systemic and mucosal safety evaluation of Bac^{OR-Fn-T+phiX174} oral vaccine

安全性评估显示，口服疫苗未引起主要器官病理损伤或血液生化指标异常。结肠组织学检查未见黏膜结构破坏，肠道菌群16S rRNA测序表明微生物丰富度保持稳定，且乳酸杆菌属（Ligilactobacillus）等有益菌丰度增加。工程菌缺乏接合转移基因且体内存留时间短，降低了水平基因转移（HGT）风险。

Immune responses and long-term immune memory induced by Bac^{OR-Fn-T+phiX174} oral vaccination

口服免疫可诱导高滴度抗OVA和TRP2抗体，并在50天后仍可检测到大量CD8⁺记忆T细胞（包括中央记忆和效应记忆亚群）。肿瘤再攻击实验显示，免疫小鼠肺部转移结节数显著减少，证明疫苗可建立持久保护性免疫。在兔模型中也观察到类似免疫效果，提示该策略具有跨物种应用潜力。

该研究通过创新性整合可控裂解益生菌载体与自组装铁蛋白抗原展示平台，解决了口服疫苗开发中的多重技术瓶颈。双抗原阵列设计通过空间协同作用增强免疫识别，RGD靶向促进肠道M细胞转运，而阿拉伯糖诱导裂解系统确保抗原在肠道靶部位精准释放。研究证实这种策略不仅能激发强大细胞和体液免疫，还可调节肿瘤微环境，建立长期免疫记忆，且具有良好安全性。这种模块化设计为开发高效、无针、易服用的下一代肿瘤疫苗提供了新范式，在转化医学领域具有重要应用前景。