SARS-CoV-2 Mpro Δ23G突变导致ensitrelvir耐药却增强nirmatrelvir敏感性的机制研究

《Nature Communications》：A SARS-CoV-2 Mpro mutation conferring ensitrelvir resistance paradoxically increases nirmatrelvir susceptibility

本研究针对SARS-CoV-2变异株对现有抗病毒药物产生耐药性的临床挑战，系统研究了Mpro蛋白酶Δ23G突变对ensitrelvir和nirmatrelvir的差异化耐药机制。研究发现该突变导致ensitrelvir耐药性增加约35倍，却使nirmatrelvir敏感性提高约8倍，并通过结构生物学揭示了β-发夹环构象变化的关键作用。该发现为临床序贯治疗策略提供了理论依据，对管理长期抗病毒治疗患者具有重要意义。

　　

随着新冠病毒(SARS-CoV-2)的持续变异，抗病毒药物的耐药性问题日益成为临床治疗的重大挑战。尽管针对病毒3CL蛋白酶(M^pro)的抑制剂nirmatrelvir（奈玛特韦）和ensitrelvir（恩司特韦）已在临床广泛应用，但病毒在药物选择压力下产生的耐药突变严重影响了治疗效果。尤其对于免疫功能低下等需要长期抗病毒治疗的患者，耐药病毒株的出现可能导致治疗失败。因此，深入研究M^pro抑制剂的耐药机制，对于制定有效的临床治疗策略至关重要。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，韩国研究团队发现了一个令人意外的现象：SARS-CoV-2 M^pro的Δ23G缺失突变在导致ensitrelvir高水平耐药的同时，竟然显著增强了病毒对nirmatrelvir的敏感性。这一发现不仅揭示了M^pro抑制剂耐药机制的复杂性，也为临床序贯或交替使用不同蛋白酶抑制剂提供了新的思路。

研究人员采用多学科交叉的研究方法，包括病毒学、结构生物学和动物模型实验。关键技术手段涵盖：通过药物压力下的病毒连续传代筛选耐药突变；利用反向遗传学技术构建重组病毒；采用酶动力学分析和等温滴定量热法(ITC)评估蛋白功能；通过X射线晶体学解析突变体三维结构；结合分子对接和分子动力学模拟分析药物结合特性；使用叙利亚金黄仓鼠模型进行体内药效和传播能力评估。

病毒传代筛选耐药突变

为模拟临床耐药发展过程，研究人员将新冠病毒武汉株和BA.5奥密克戎株在ensitrelvir浓度递增的条件下连续传代培养。通过下一代测序(NGS)技术，在武汉株背景中鉴定出M^pro-Δ23G/T45I和M^pro-M49L突变株，在BA.5背景中鉴定出M^pro-S144A和M^pro-P252L突变株。抗病毒敏感性测试显示，Δ23G/T45I双突变株对ensitrelvir的耐药性提高了约35倍，而对nirmatrelvir的敏感性却增强了约8倍，呈现出明显的"反向耐药"特征。

重组病毒验证差异化耐药表型

为明确Δ23G突变的核心作用，研究团队利用反向遗传学技术构建了携带单一突变(Δ23G或T45I)和双突变(Δ23G/T45I)的重组病毒。体外实验证实，Δ23G是导致ensitrelvir耐药的主要因素，而T45I突变则主要起补偿功能。酶动力学分析显示，Δ23G突变显著降低了M^pro的催化效率(k_cat/K_m)，而T45I的共存部分恢复了酶活性。

结构生物学揭示分子机制

通过解析M^pro-Δ23G及其与nirmatrelvir复合物的晶体结构，研究人员发现Δ23G缺失引起了β-发夹环(Cys22-Thr26)和催化环(Ile136-Val148)的显著构象变化。特别重要的是，Phe140发生了约9.8?的外移，破坏了其与His163的π-π堆积相互作用，导致催化中心结构不稳定。这种构象变化直接影响了ensitelvir与Thr26的氢键结合，而nirmatrelvir因不依赖此结合位点，反而能更紧密地与突变蛋白酶结合。

体内外验证病毒适应性代价

在仓鼠感染模型中，携带Δ23G突变的病毒表现出明显的适应性缺陷，包括复制能力下降、致病性减弱和传播能力受限。值得注意的是，气溶胶传播实验显示Δ23G突变株通过空气传播的能力显著受损。然而，在ensitrelvir药物选择压力下，Δ23G突变株能够快速占据优势种群，凸显了其在临床治疗环境中出现的风险。

研究结论与讨论部分强调，M^pro-Δ23G突变呈现出独特的"反向耐药"特征：一方面导致ensitrelvir高水平耐药，另一方面增强对nirmatrelvir的敏感性。这种差异化耐药模式主要源于Δ23G诱导的β-发夹环构象重排，特异性影响ensitelvir的结合而不干扰nirmatrelvir的作用。尽管Δ23G突变本身会带来显著的适应性代价，但T45I等补偿性突变可以部分恢复病毒 fitness，增加了耐药株在人群中传播的风险。

该研究的重要意义在于首次系统揭示了M^pro抑制剂之间存在差异化耐药机制，为临床治疗策略提供了重要启示：对于需要长期抗病毒治疗的患者，可以考虑序贯或交替使用不同机制的蛋白酶抑制剂，从而有效管理耐药问题。同时，研究强调需要持续监测新冠病毒基因组中出现的耐药突变，特别是关注Δ23G等可能影响多重药物敏感性的关键突变，为未来抗病毒药物的合理使用和新型抑制剂设计提供了重要理论基础。