基于配对连接子纳米孔的光控合成通讯网络构建及其正交信号传递研究

《Nature Communications》：Light-controlled synthetic communication networks via paired connexon nanopores

本研究针对脂质体合成细胞(SCs)间难以实现高保真、特异性信号传递的挑战，创新性地利用工程化连接蛋白(Cx43和Cx32)构建了光控的跨膜通道。研究人员通过结合E-钙粘蛋白(EC1-2)介导的细胞粘附以及紫外(UV)和近红外(NIR)光激活的蛋白酶释放系统，成功实现了SC间正交、可逆的分子信号传递，并演示了基于点击化学的信号处理逻辑运算，为合成生物学组织工程和生物计算提供了新范式。

　　

在生命系统中，细胞通过复杂的通讯网络协同工作，实现组织层面的功能协调，例如群体感应和组织形态发生。这种通讯依赖于细胞间精准的分子信号传递。合成生物学的一个核心目标是利用自下而上的方法，在合成细胞中模拟这种复杂的通讯行为。合成细胞通常是基于脂质体的微米级囊泡，能够模拟细胞的形态和某些功能，是构建新型生物材料和器件的理想平台。然而，在基于脂质双分子层的合成细胞之间实现高效、特异性的信号传递一直是一个重大挑战。主要的难点在于，信号分子必须连续穿过两个膜结构才能在不同合成细胞之间传递信息，而传统的信号释放方式（如通过表达膜孔蛋白）往往导致信号分子泄漏到胞外环境中，造成信号丢失和非特异性扩散，限制了传递的保真度和特异性。

为了解决这一难题，研究人员尝试通过工程化粘附分子将合成细胞拉近，以促进接触依赖的信号传递。尽管取得了一些进展，但能够对通讯时机进行精确外部控制（如光控），并且能实现不同信号通路间正交（互不干扰）通讯的合成细胞系统仍然非常有限。一个理想的解决方案是构建一种能够直接连通两个相邻合成细胞内部腔室的蛋白质通道，类似于天然细胞中的间隙连接。间隙连接由连接蛋白构成，其在细胞膜上组装成六聚体的连接子（或称半通道），两个相邻细胞的连接子可以对接形成完整的跨细胞通道，允许小分子直接交换。如果能在合成细胞中重建这种受控的通道系统，将极大提升合成通讯网络的性能。

在这篇发表于《自然·通讯》的研究中，来自德克萨斯大学奥斯汀分校的Brian Belardi团队及其合作者报道了一项突破性进展：他们成功构建了由光控制的合成细胞通讯网络。该网络基于配对连接子纳米孔，实现了波长依赖的正交分子信号传递和化学反应控制。

为开展本研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：利用无细胞蛋白质表达系统在合成细胞内原位表达工程化连接蛋白（Cx43和Cx32）；采用E-钙粘蛋白胞外域（EC1-2）介导合成细胞间的特异性粘附；构建了分别响应紫外光和近红外光的光敏脂质体，用于控制封装在其中的蛋白酶（TEV或TVMV）的释放；通过荧光染料和荧光底物（如CalFluor azides与PEG-DBCO的点击化学反应）示踪分子传递和反应过程；利用共聚焦荧光显微镜进行成像和定量分析。

研究结果

粘附接触增强合成细胞间连接蛋白通道的形成

研究人员首先探讨了在合成细胞间组装连接蛋白43通道的可行性。他们将表达Cx43的“发送者”合成细胞（封装有可溶性染料Alexa Fluor 647）与“接收者”合成细胞混合。为了促进通道形成，他们在合成细胞膜上引入了带有组氨酸标签的E-钙粘蛋白胞外域片段（EC1-2），并通过DGS-NTA(Ni)脂质将其锚定在膜上。结果表明，仅在Cx43表达和EC1-2介导的粘附同时存在时，才能观察到显著的染料转移（约50%）。使用更长的E-钙粘蛋白片段（EC1-3或EC1-5）会降低转移效率，推测是由于增加了膜间距离，导致膜弯曲能垒升高。此外，去除Ca²⁺（EC1-2粘附所需）或添加Cx43通道抑制剂Gap26均可 abolish 染料转移，证实了转移过程依赖于Cx43通道功能和细胞粘附。

配对不相容的连接子形成正交通道并导致非混合传递路径

为了构建正交通讯通路，研究人员引入了另一种连接蛋白亚型——连接蛋白32。研究发现，Cx32也能在EC1-2介导的粘附下形成功能性的细胞间通道，但其染料传递效率低于Cx43。关键的是，当表达Cx43的发送者细胞与表达Cx32的接收者细胞配对时，染料转移被有效阻断，这与天然细胞中Cx43和Cx32存在配对不相容性的报道一致。这种不相容性源于两者第二胞外环关键残基的差异。在一个三群体合成细胞实验中，发送者细胞只将染料传递给表达相同连接蛋白亚型的接收者细胞，证明了基于连接蛋白配对特异性的正交通讯路径的可能性。

光激活的Cx43通道在合成细胞间的组装

为了实现通讯的时间控制，研究人员利用了他们之前开发的蛋白酶依赖的Cx43工程变体。该变体在N端连接了一个庞大的mCherry域，其后是烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列。这个庞大的域会阻碍连接子的功能组装。他们将TEV蛋白酶封装在紫外光响应的脂质体内，并共同包裹在表达该工程Cx43变体的合成细胞中。紫外照射导致脂质体破裂，释放TEV蛋白酶，进而切割mCherry域，激活Cx43连接子。实验证明，只有在紫外光照射下，粘附的合成细胞间才发生显著的染料转移，其效率与直接封装可溶性TEV蛋白酶的对照组相当。此外，他们还开发了近红外光激活的系统，将TEV蛋白酶和金纳米棒共同封装在DPPC脂质体中。近红外光被金纳米棒吸收并转化为热量，导致脂质体破裂释放TEV。该系统同样能有效激活Cx43连接子功能和细胞间染料传递，并且与紫外系统表现出良好的正交性。

近红外光激活的TVMV蛋白酶依赖性Cx32通道组装

为了独立控制Cx32通道，研究人员构建了类似的蛋白酶敏感Cx32变体，但其N端庞大域后连接的是烟草脉斑花叶病毒蛋白酶识别序列。将TVMV蛋白酶封装在近红外光响应的脂质体中并导入表达该工程Cx32变体的合成细胞。近红外照射后，TVMV蛋白酶被释放并切割mCherry域，从而激活Cx32连接子孔道活性和细胞间染料转移。重要的是，TEV和TVMV蛋白酶系统之间没有交叉反应，确保了Cx43和Cx32激活的正交性。

用户控制的合成细胞间正交通讯网络

最终，研究人员创建了同时包含紫外光激活Cx43系统和近红外光激活Cx32系统的“双连接蛋白”合成细胞。将这些“双Cx”发送者细胞与分别表达Cx43或Cx32的接收者细胞粘附在一起。在没有光照时，几乎检测不到染料转移。紫外光照射选择性地激活了从“双Cx”发送者到Cx43接收者的传递，而近红外光照射则优先激活到Cx32接收者的传递。这证明了用户可以通过选择不同波长的光来定义合成细胞组装体中的独立信号路径。

用户控制的合成细胞间不同化学产物的生成

为了展示该平台在信号处理方面的潜力，研究人员进行了一项基于点击化学的反应演示。他们构建了一个三群体系统：“双Cx”接收者细胞封装有PEG-DBCO；UV-Cx43发送者细胞封装有CalFluor 647叠氮化物；NIR-Cx32发送者细胞封装有CalFluor 488叠氮化物。这些CalFluor叠氮化物在与DBCO发生点击反应前几乎无荧光，反应后产生强荧光。在没有光照时，系统处于“暗态”。紫外光照射导致CF647从UV-Cx43发送者转移到“双Cx”接收者，并与PEG-DBCO反应产生红色荧光产物（“红态”）。近红外光照射则导致CF488转移和反应，产生绿色荧光产物（“绿态”）。同时照射两种光则产生两种产物（“黄态”）。该系统成功模拟了基于信号传递和处理的、具有四种不同输出状态的逻辑运算。

结论与意义

本研究成功地在合成细胞之间建立了直接、高保真的分子信号传递通道，这是构建复杂合成通讯网络的关键一步。其重要意义在于：首先，通过将天然的连接蛋白、粘附蛋白与人工的光控系统相结合，赋予了合成细胞快速、正交可控的通讯能力，这是天然细胞或纯人工材料难以实现的。其次，利用配对不相容的连接蛋白亚型（Cx43和Cx32），实现了SC组装体中特定的、互不干扰的信息传递路径。更重要的是，通过耦合光控传递与点击化学反应，演示了超越二进制语言的多种信号处理状态，为合成生物学在再生医学、高级传感和软计算等领域的应用提供了新的思路和工具。该研究展示的“双连接蛋白”合成细胞概念，类似于一个未分化的多能干细胞，能够根据用户施加的光刺激不可逆地分化为不同状态，为合成形态发生和可编程生物材料的设计开辟了新途径。尽管当前系统在背景泄漏和蛋白质表达均一性方面仍有提升空间，但随着合成细胞制备技术的进步，整合更多连接蛋白亚型以实现多信号并行处理和复杂计算功能将成为可能。