BCL-xL复合物中尾锚通过变构调控BH3沟槽相互作用限制BH3模拟物的拮抗作用

《Nature Communications》：Allosteric regulation of BH3-in-groove interactions by tail anchors of BCL-xL complexes limits BH3 mimetic antagonism

本研究揭示了BCL-2家族蛋白BCL-xL与其配体PUMA的C端跨膜尾锚（TA）通过变构调控BH3结构域与疏水沟槽的结合，从而影响BH3模拟物（BH3m）的拮抗效率。研究人员通过BRET/FRET、分子动力学模拟及生化分析发现，双锚定膜上的PUMA/BCL-xL复合物形成更稳定的高阶结构，并招募BAX/BAK，进而增强对BH3m的敏感性。该研究为理解BCL-2家族蛋白在膜上的动态调控及开发新型抗癌策略提供了新视角。

　　

在细胞生命与死亡的精密调控中，BCL-2家族蛋白扮演着核心角色。它们如同细胞命运的“守门人”，通过复杂的相互作用网络决定细胞是走向生存还是凋亡。其中，抗凋亡蛋白如BCL-xL能够“束缚”促凋亡蛋白，从而抑制线粒体外膜透化（MOMP）这一凋亡关键事件。基于这一机制开发的BH3模拟物（BH3m）是一类有望抗癌的小分子药物，它们通过竞争性结合BCL-xL的BH3结合沟槽，释放促凋亡蛋白，从而诱导癌细胞死亡。然而，临床应用中BH3m的疗效并非总是理想，常出现耐药或剂量限制性毒性，这提示我们对细胞内BCL-2家族蛋白相互作用的真实情境——尤其是在细胞膜这一关键战场——的理解仍存在巨大空白。一个核心的未知问题是：细胞内的膜环境如何影响BCL-xL与其配体的结合，进而调控BH3m的药效？由Laurent Maillet和Philippe Paul Juin等人完成的最新研究，正是为了解开这个谜团。

为了回答上述问题，研究人员综合运用了多种先进的技术方法。他们主要在人类癌细胞系（如MCF-7和HCT116）中进行实验，关键技术包括：利用生物发光/荧光共振能量转移（BRET/FRET）技术在活细胞中实时定量分析蛋白质相互作用；通过分子动力学（MD）模拟和MM/GBSA（分子力学结合广义玻恩和表面积近似）计算，在原子水平上研究膜锚定蛋白复合物的构象动力学和结合能；采用细胞亚组分分离、蓝色原生凝胶电泳（BN-PAGE）和免疫共沉淀结合质谱分析，来解析蛋白质的亚细胞定位、复合物组成及相互作用组；并利用CRISPR-Cas9技术构建基因敲除细胞系，以及使用邻近连接 assays（PLA）和基于活细胞成像的细胞死亡分析来验证功能。

RESULTS

In cell, BCL-xL binds to BH3 domains via the canonical mode.

研究人员首先通过BRET实验证实，在活细胞中，分离的PUMA、BIM和tBID的BH3结构域能以经典方式结合BCL-xL的疏水沟槽，且这种结合能被BCL-xL特异性的BH3m（如WEHI-539, A-11555463, A-1331852）以剂量依赖的方式拮抗，其效力与这些化合物在无细胞实验中测得的亲和力相关。这表明BH3结合沟槽的结构-活性关系在不同背景下是保守的。

BH3 domain is a non-unique determinant for initiator/ BCL-xL interaction

然而，当使用全长起始蛋白（如PUMA或BIM）与BCL-xL进行相互作用研究时，情况变得复杂。虽然BH3结构域的突变仍会影响结合，但全长蛋白形成的复合物对BH3m拮抗的抵抗力显著强于单独的BH3结构域。这意味着，除了BH3结构域本身，起始蛋白的其他分子特征也赋予了它们相对于BH3m的竞争性优势。

TAs cooperate to form BH3m-resistant complexes

研究人员将目光投向了蛋白质的C端尾锚（TA）。PUMA和BIM对BH3m的抵抗性强于tBID或BAD。通过构建嵌合体蛋白（如将PUMA的BH3域替换为BID的BH3域），他们发现PUMA的TA是其复合物抵抗BH3m的关键。删除PUMA或BCL-xL的TA，都会显著增加复合物对BH3m的敏感性。这表明PUMA和BCL-xL的TA在功能上协同作用，共同促进了复合物对抗BH3m诱导解离的稳健性。

Membrane anchoring of PUMA and BCL-xL orients BH3 groove toward lipids

为了探究分子机制，他们进行了分子动力学模拟。结果显示，当PUMA和BCL-xL都通过其TA锚定在膜上时（dNPUMA/BCL-xL复合物），两者的TA在膜内形成近乎平行的双kink（弯折）构象，这种构象限制了BCL-xL球状部分的运动，使其BH3结合沟槽界面稳定地朝向脂膜。相反，若只有BCL-xL被锚定（PUMABH3/BCL-xL复合物），其球状部分活动自由度更大，BH3结合界面更容易脱离膜环境而暴露于溶剂中。这种空间取向的差异可能影响BH3m的接近和结合。

Double tail anchoring allosterically regulates the BH3-in-groove interface

结合自由能计算（MM/GBSA）进一步揭示，双锚定（dNPUMA/BCL-xL）比单锚定（PUMABH3/BCL-xL）涉及更多BCL-xL残基的贡献，结合能更高，且结合界面发生了改变。特别是一些关键残基（如BCL-xL的E96）对结合能的贡献在PUMA TA存在时尤为显著。点突变实验证实，破坏这种变构调控（如E96A突变）会改变BCL-xL的膜取向，并增强复合物对BH3m的敏感性。这强有力地证明了PUMA和BCL-xL的TA确实以变构方式调控了BH3结构域与沟槽的结合界面。

Membrane-anchored PUMA promotes BCL-xL assembly into higher-order complexes

生化分析表明，膜锚定的PUMA能促进BCL-xL在细胞内膜结构（如线粒体）上的富集，并形成超越简单异源二聚体的高阶蛋白质复合物。而缺乏TA的PUMA则无此效应。蛋白质组学分析发现，PUMA的存在增强了BCL-xL与多种线粒体和内质网蛋白的相互作用，其中包括执行蛋白BAX和BAK。

BCL-xL BH3m antagonism fails independently of MCL-1 compensation

在功能上，共表达PUMA和BCL-xL的细胞对BH3m A-1331852诱导的细胞死亡更敏感，但这种敏感性在PUMA缺失TA时更高。即使联合使用MCL-1抑制剂S-63845，膜锚定PUMA的存在依然限制了BH3m诱导死亡的效果，表明MCL-1的代偿作用在此背景下受限。这揭示了膜锚定赋予PUMA/BCL-xL复合物的独特功能特性。

BAX sensitizes doubly anchored PUMA/ BCL-xL to BH3m antagonism by its TA

有趣的是，BAX和BAK的缺失会降低双锚定PUMA/BCL-xL复合物对BH3m的敏感性，但对单锚定或tBID/BCL-xL复合物无影响。机理探究表明，BAX并非通过其BH3结构域与BCL-xL沟槽竞争，而是通过其TA与BCL-xL的TA发生相互作用来发挥增敏作用。将BCL-xL的TA替换为BAX的TA（嵌合体BCL-xL-C_BAX）能增强BH3m的拮抗效力，且此效应依赖于BAX/BAK的存在以及TA间的相互作用位点。在细胞中表达仅包含BAX TA的工程蛋白，也能增强BH3m对PUMA/BCL-xL细胞的杀伤作用。

讨论与结论

本研究系统地揭示了BCL-2家族蛋白相互作用中一个此前未被充分认识的调控层面：蛋白质的C端尾锚通过变构机制远程调控其核心的BH3-沟槽结合界面。这不仅解释了为何膜锚定的PUMA/BCL-xL复合物能抵抗BH3m的解离，也阐明了BAX作为该网络的关键负反馈调节因子，通过其TA干扰BCL-xL TA的构象，从而促进BH3m功效的新机制。

这项研究具有多重重要意义。首先，它强调了在接近生理状态的膜环境下研究蛋白质相互作用的重要性，挑战了主要基于可溶性系统或缺失TA蛋白的研究结论。其次，它为理解BH3m的耐药性提供了新的分子解释，并指出BAX的表达水平可能作为预测癌细胞对BCL-xL抑制剂敏感性的潜在生物标志物。最后，该研究为开发新的治疗策略指明了方向：例如，设计能够靶向TA诱导的变构调控位点的新一代BH3沟槽拮抗剂，或将BAX激活剂与BCL-xL拮抗剂联用，以及开发模拟BCL-xL、PUMA或BAX的TA功能的肽段或小分子以调节BH3m的疗效。

总之，这项发表于《Nature Communications》的工作深化了我们对BCL-2家族蛋白在细胞膜上精细调控凋亡的理解，揭示了蛋白质局部化与构象动力学在决定细胞命运和药物反应中的核心作用，为改进针对这一重要蛋白家族的癌症治疗策略奠定了坚实的理论基础。