呼吸复合物I外围簇N1a氧化还原电位调控的结构基础与机制研究

《Structure》：Structural changes shifting the redox potential of the outlying cluster N1a in respiratory complex I

本研究针对呼吸复合物I中非电子传递链成员——铁硫簇N1a的功能谜题，通过解析突变体X射线晶体结构和冷冻电镜结构，首次证实突变体仍完整保留N1a簇，并揭示其微环境结构变化通过改变肽键构象和氢键网络，导致氧化还原电位显著降低（从-250 mV降至<-440 mV）。该发现阐明了N1a电位调控的分子基础，为理解复合物I的电子分配机制和抗氧化防御策略提供了关键结构证据。

　　

作为能量代谢的核心引擎，呼吸复合物I（NADH:泛醌氧化还原酶）通过耦合NADH氧化与质子跨膜转运，驱动ATP合成。然而，其电子传递链中一个特殊成员——铁硫簇N1a，却始终笼罩在谜团之中。这个保守的[2Fe-2S]簇虽然不参与主电子传递路径，却与初级电子受体FMN（黄素单核苷酸）仅距12.3 ?，暗示其可能承担着独特的调控功能。更令人困惑的是，不同物种中N1a的氧化还原电位存在显著差异：在大肠杆菌中表现为-250 mV的"高电位"特征，可被NADH还原；而在哺乳动物中却呈现-400 mV的"低电位"特性，难以被常规还原剂还原。

先前研究表明，通过定点突变可改变N1a的氧化还原特性，但突变体是否仍能正常结合该簇？结构变化如何影响其电化学性质？这些关键问题一直悬而未决。为解决这一科学难题，研究团队综合运用X射线晶体学和冷冻电镜技术，对突变型复合物I开展了系统性结构解析。

研究主要采用以下技术路径：首先通过定点突变技术构建NuoE亚基的V90P^E、V136M^E单突变及双突变体；利用镍亲和层析、分子筛层析等多步纯化策略获得高纯度蛋白样品；采用坐滴气相扩散法培养突变体晶体，并在瑞士光源进行高分辨率X射线衍射数据收集；同时通过冷冻电镜技术解析全长大肠杆菌复合物I突变体的结构，最终利用EPR光谱验证突变对簇电位的影响。

结构解析确认N1a簇的完整性

晶体结构数据显示，所有突变体均保持完整的N1a簇结合，分辨率达1.8-2.6 ?。在V90P^E突变体中，I89^E的肽键碳基发生顺式构象翻转，使其羰基氧与N1a的S2硫原子距离从5.5 ?缩短至3.2 ?，同时组氨酸H92^E旋转至新形成的空腔中，改变了与NuoF亚基的氢键网络。而V136M^E突变则引入甲硫氨酸的δ-硫原子，使其位于N1a的S1硫原子5.8 ?范围内，增加了簇周围的电子密度。

双突变体呈现叠加效应

V90P^E/V136M^E双突变体结构显示两种突变效应相互独立叠加，但未产生协同放大作用。值得注意的是，NAD⁺结合实验表明突变并未影响核苷酸与FMN的结合模式，证实电位变化源于簇微环境的特异性改变而非底物结合障碍。

EPR光谱验证电位偏移

EPR分析显示，经NADH还原后，野生型NuoEF中N1a信号完全还原，而V136M^E突变体信号强度降至60%（电位约-370 mV），V90P^E突变体进一步降至30%（电位约-400 mV），双突变体几乎检测不到信号（电位<-440 mV）。这一结果与大肠杆菌复合物I突变体的电化学特征高度一致。

跨物种结构比较揭示保守机制

冷冻电镜解析的大肠杆菌V96P^E/N142M^E复合物I结构（分辨率2.35 ?）显示，虽然物种间第二配位圈存在差异（如E.coli的N142^E突变为M142^E后破坏了与N1a的氢键网络），但核心突变效应与Aquifex aeolicus变异体高度相似。特别值得注意的是，尽管该突变使N1a电位显著降低，但对NADH:癸基醌氧化还原酶活性影响甚微（野生型39.6 U/mg vs 突变体31.0 U/mg），且不影响醌结合位点功能。

讨论部分深入阐释了N1a簇的功能意义。在高电位N1a的复合物I中，该簇可能通过调控E95^F-S96^F肽键构象翻转，增强NAD⁺结合稳定性，从而防止FMN半醌自由基积累和活性氧产生。而在低电位变体中，这种调控机制失效，导致NAD⁺解离加速。研究通过比较不同物种的NuoE-NuoF界面结构，发现尽管水分子的空间分布高度保守，但N1a电位差异直接决定了电子是否从FMN流向该簇。

这项研究首次在原子水平揭示了呼吸复合物I中N1a簇氧化还原电位调控的结构基础，阐明了该保守簇在电子分配和抗氧化防御中的潜在功能。不仅解决了长期存在的科学争议，也为理解复合物I相关疾病（如线粒体疾病）的分子机制提供了重要理论依据。论文发表于《Structure》期刊，为能量代谢相关药物的开发提供了新的靶点视角。