心外膜前体区域存在血管平滑肌和窦房结祖细胞的独特群体——为心脏发育提供早期命运图谱

《Cell Reports》：Distinct populations of vascular smooth muscle and sinoatrial progenitors are localized adjacent to pro-epicardium

本研究针对心外膜前体(PE)区域细胞命运特化的关键科学问题，通过单细胞mRNA深度测序(scRNA-DSeq)结合遗传谱系追踪技术，揭示了该区域存在三个空间定位 distinct 的祖细胞群体：经典心外膜前体(pro-EpiCs)、血管平滑肌细胞(VSMC)样祖细胞和起搏器祖细胞(PMPCs)。研究证实VSMC祖细胞在E9.5即已特化，而纤维母细胞则在E10.5后于心外膜中分化。该发现为心脏细胞命运决定机制提供了新的发育路线图，对先天性心脏病诊疗具有重要启示。

　　

心脏作为人体最重要的器官之一，其发育过程涉及多种细胞类型的精密协调。心外膜前体(pro-epicardium, PE)作为心脏发育过程中的临时细胞群，长期以来被认为是产生心外膜细胞(EpiCs)的均匀结构。这些心外膜细胞随后通过上皮-间质转化(EMT)进入心肌，分化为冠状动脉血管平滑肌细胞(cVSMCs)、成纤维细胞等关键细胞类型。然而，一个长期悬而未决的科学问题是：这些不同的细胞命运是何时、何地被决定的？是在PE区域、心外膜还是心肌中特化的？传统观点认为PE是一个相对均匀的结构，但表达PE标记物的区域实际上比PE本身更广泛，这提示PE周围可能存在具有不同发育潜能的细胞群体。

为了解答这一发育生物学的重要问题，Miao等人发表在《Cell Reports》上的研究，通过高精度的单细胞分析技术，揭示了PE区域前所未有的细胞异质性。研究人员发现，这个一度被认为均匀的区域，实际上包含着三个空间定位 distinct 的祖细胞群体，各自具有独特的基因表达谱和命运潜能，为心脏发育提供了早期命运图谱。

研究团队主要运用了以下关键技术：首先，利用Tbx18Cre/+; mTmG基因型小鼠标记PE区域细胞，通过流式细胞术分选GFP阳性细胞进行单细胞mRNA深度测序(scRNA-DSeq)，平均每个细胞获得约200万条 reads，确保了转录本的高覆盖率。其次，通过RNAScope荧光原位杂交技术验证细胞群体的空间定位。第三，构建了新型MyrfPreERT2/+基因敲入小鼠系，结合Cre-Lox和Dre-Rox双报告系统进行精准的谱系追踪。最后，利用生物信息学分析包括基因本体论(GO)分析和Reactome通路分析来解析不同细胞群体的功能特征。

Tbx18Cre/+标记的PE区域细胞具有异质性，呈现三个具有不同表达谱的簇群

研究人员首先从约E9.5的Tbx18Cre/+; mTmG胚胎中分离PE区域GFP阳性细胞进行scRNA-DSeq分析。通过对74个高质量细胞的分析，发现它们可清晰地分为三个簇群。簇1细胞特异性表达Upk3b、Vwa1和Sowahd等基因，高表达WT1、Tbx18、Tcf21等经典pro-EpiC标记物，GO分析显示其富集于细胞膜组分和器官发育过程，表明它们对应于PE本身，即经典的心外膜前体细胞。

三个簇群的细胞在PE区域显示 distinct 但相邻的定位

通过RNAScope空间转录组学分析，研究人员证实了这三个簇群在PE区域具有 distinct 的空间分布。簇1（标记物Scx）局限于PE本身，即绒毛状突起和囊肿形成的区域。簇2（标记物Pdgfrb）主要定位于PE的后方区域。而簇3（标记物Ppargc1a）则位于PE区域靠近心房壁的近端。多重RNAScope进一步显示这三个群体在空间上基本不重叠。

簇2中的细胞是平滑肌样细胞

簇2细胞特异性表达Pdgfrb和Upp2，同时高表达Myocd（心肌素）。与簇1相比，簇2细胞中平滑肌细胞标志物（如Cald1、Tagln、Acta2）的表达水平显著更高，但成熟标志物Myh11未表达，表明它们是不成熟的VSMC样细胞。为了验证簇2细胞的命运潜能，研究人员利用PdgfrbCreERT2/+进行谱系追踪。在E8.5诱导他莫昔芬后，于E17.5观察到标记细胞定位于心外膜和冠状动脉血管周围，约34.8%的cVSMCs被标记，但这些细胞几乎不表达成纤维细胞标志物Pdgfra（仅1.1%），表明簇2细胞在E8.5时已特化为VSMC命运。

成纤维细胞在约E10.5时开始在心外膜内分化

对成纤维细胞标志物的分析显示，成熟标志物在三个簇群中均无显著富集。利用Col1a2CreERT2/+进行的谱系追踪发现，在E8.5诱导时，几乎无法标记E9.5的pro-EpiCs；而在E10.5诱导、E14.5检测时，约11.2%的EpiCs被标记，且这些标记细胞不表达心肌细胞或内皮细胞标志物，但约35.3%表达成纤维细胞标志物Vimentin。这表明成纤维细胞的分化始于心外膜阶段（约E10.5），而非PE区域。

簇3中的细胞表达起搏器心肌细胞标志物，是起搏器祖细胞

簇3细胞高表达心肌细胞特异性标志物（如Myh6、Tnni3），但不表达心房心肌细胞标志物Cx40(Gja5)和Nppa。相反，它们特异性表达起搏器细胞关键调控因子，如Hcn4、Shox2、Ryr2等。免疫荧光染色证实，部分Tbx18Cre/+标记的MF20阳性细胞（心肌细胞）定位于流入道心房内的PE区域。Hcn4-GFP报告基因小鼠也显示，Hcn4阳性细胞 precisely 定位于簇3所在的区域（PE近心房壁端）。

窦房结细胞起源于近心房壁的PE区域

为了确证簇3细胞是起搏器祖细胞(PMPCs)并贡献于窦房结(SAN)，研究人员采用了双报告基因谱系追踪系统。在MyrfPreERT2/+; Shox2Cre/+; Ai66D胚胎中，于E8.5诱导他莫昔芬后，E9.5时标记细胞定位于PE近心房壁区域；E16.5时，标记细胞出现在SAN区和房间隔，其中82.7%的Hcn4阳性细胞被双报告基因标记，且这些细胞表达MF20和Collagen IV，但不表达Cx43或PECAM，证实其为SAN细胞。使用另一种双报告系统（MyrfPreERT2/+; Shox2Cre/+; R26TLR）也得到了一致的结果。对22个簇3细胞的深入scRNA-DSeq分析显示，这些PMPCs表达心外膜标志物（低水平）、动作电位相关基因、心肌收缩基因以及起搏器分化调控基因（如Tbx3、Tbx5、Isl1）。值得注意的是，14个PMPCs不表达或仅低表达Tbx3，提示可能存在Tbx3阴性和Tbx3阳性PMPCs亚群，前者可能是后者的前体。

本研究通过高精度的单细胞分析技术，彻底改变了我们对心外膜前体区域的认识。研究发现该区域并非均匀结构，而是包含着三个空间定位和命运潜能各异的祖细胞群体：产生心外膜细胞的经典pro-EpiCs（簇1）、在发育极早期（E9.5）即已特化并注定分化为冠状动脉平滑肌细胞的VSMC样祖细胞（簇2）、以及定位于PE近心房壁区域、最终贡献于窦房结形成的起搏器祖细胞（簇3）。此外，研究明确了成纤维细胞的特化发生时间较晚（约E10.5后），位于心外膜而非PE区域。这些发现不仅为心脏发育的细胞谱系建立了清晰的早期路线图，而且对理解先天性心脏病（如冠状动脉异常、心律失常）的病因提供了重要的发育生物学基础。研究所构建的新型遗传工具鼠（如MyrfPreERT2/+）和双报告基因系统，也为未来心血管发育与再生医学研究提供了宝贵资源。