人肠道上皮细胞成熟过程通过顶端表面糖萼强化抵御沙门氏菌侵袭的机制研究

《Cell Reports》：Maturation of human intestinal epithelial cell layers fortifies the apical surface against Salmonella attack

本研究针对肠道病原体入侵机制研究缺乏生理相关模型的问题，开发了可实时成像的人肠道类器官来源上皮细胞层资源，揭示了细胞成熟状态通过调控肌动蛋白调节因子表达、改变顶端表面糖萼组成（特别是MUC13等膜结合黏蛋白）显著降低沙门氏菌（S. Tm）侵袭能力的机制，为宿主-病原体相互作用研究提供了重要平台。

　　

肠道是人体抵御病原体入侵的第一道防线，而上皮细胞的入侵是许多肠道致病菌感染的关键步骤。尽管科学家们对沙门氏菌（Salmonella Typhimurium, S. Tm）等病原体的入侵机制已有数十年研究，但这些认识主要来源于肿瘤细胞系实验，与真实人体肠道环境存在显著差异。传统的细胞模型虽然操作简便，但缺乏天然肠上皮的复杂结构特征——极化的细胞排列、密集的微绒毛以及高度糖基化的顶端表面。这种差异导致我们对病原体如何攻击真实人体肠道上皮的认识存在巨大空白。

随着类器官技术的革命性发展，研究人员现在能够从成人肠道干细胞培养出纯上皮细胞模型，为研究病原体与非转化上皮的相互作用提供了全新平台。在这项发表于《Cell Reports》的研究中，van Rijn、Lopes等作者开发了一套灵活的研究资源，能够在不同分化状态和黏液产生条件下，对人肠道类器官来源的上皮细胞层进行活细胞感染成像。

研究团队建立了来自空肠和结肠的二维上皮细胞层培养系统，通过调控培养基成分（OGM、ENR、ENRRT条件）精确控制上皮细胞的成熟状态。他们发现，未成熟的上皮细胞层对S. Tm入侵高度易感，而向吸收性肠上皮细胞/结肠细胞表型成熟后，上皮细胞的易感性降低了高达10倍。这种保护作用与肌动蛋白调节蛋白（如CDC42、RHOA、ARF1）表达下调、对S. Tm效应蛋白SipA依赖性增加以及顶端表面糖萼（特别是MUC13等膜结合黏蛋白）的积累密切相关。更重要的是，使用StcE酶处理去除表面黏蛋白可完全消除成熟上皮的抵抗能力。

研究采用的主要技术方法包括：人肠道类器官来源上皮细胞层的定向分化培养、顶端成像室（AIC）活细胞感染时序成像、转录组和蛋白质组分析、扫描电子显微镜表面超微结构观察、条形码联合感染实验以及黏蛋白酶处理功能验证。所有人类肠道样本均来自手术切除组织，经伦理审查委员会批准。

人类肠道上皮细胞层具有不同的成熟状态，兼容活细胞顶端表面成像

研究人员在顶端成像室（AIC）中建立了可兼容活细胞成像的二维上皮细胞层面板。通过不同的培养基条件（OGM、ENR、ENRRT）成功诱导出不同成熟状态的上皮细胞：OGM条件维持未成熟增殖表型，ENR条件促进向肠上皮细胞样状态成熟，ENRRT条件则部分偏向M细胞样状态。转录组和蛋白质组分析证实了这三种细胞状态的显著差异，扫描电镜显示ENR条件下的细胞具有更密集的微绒毛结构。

联合Notch抑制和气液界面培养产生黏液生成的结肠上皮细胞层，延迟沙门氏菌到达表面

研究人员进一步开发了cENR+DAPT+ALI（气液界面）培养条件，成功在结肠类器官来源的细胞层中诱导出大量杯状细胞和可溶性MUC2黏液产生。功能实验表明，这种黏液层可延迟S. Tm到达上皮表面6.5-8倍，证明了其在物理屏障中的作用。

人肠道上皮细胞向肠上皮细胞/结肠细胞状态分化降低对沙门氏菌入侵的易感性

活细胞成像结果显示，未成熟的OGM细胞层中约50%的表面附着S. Tm成功入侵，而成熟的ENR细胞层中仅有≤10%的细菌入侵。M细胞样ENRRT细胞层则表现出最高的易感性（约70%）。这一现象在空肠和结肠来源的细胞层中均得到验证，并通过庆大霉素保护实验和多孔板感染实验进一步证实。

沙门氏菌在未成熟与成熟人肠道上皮细胞层中入侵过程的特征

蛋白质组分析发现，成熟ENR细胞层中多种肌动蛋白调节因子表达降低。虽然S. Tm在两种细胞层中均能诱导入口结构形成，但ENR条件下的入口结构面积更小（减小36%），持续时间相似（约7-8分钟）。条形码联合感染实验显示，SipA效应蛋白在人类肠道上皮细胞入侵中起关键作用，特别是在成熟细胞层中。

人肠道上皮细胞成熟通过膜上防御强化顶端表面抵抗沙门氏菌攻击

研究发现，上皮细胞成熟伴随着顶端表面结构的显著变化：微绒毛密度增加、微绒毛交联钙黏蛋白（CDHR2、CDHR5）表达上调、膜结合黏蛋白（MUC1、MUC13）积累以及糖基化模式改变。最重要的是，使用StcE酶处理去除表面黏蛋白可完全逆转成熟上皮对S. Tm入侵的抵抗能力，证明顶端表面糖萼的物理屏障作用是防御机制的关键组成部分。

研究结论表明，人肠道上皮细胞的成熟状态是决定其对细菌入侵易感性的关键因素。未成熟上皮细胞类似于传统肿瘤细胞系，对S. Tm入侵高度易感，而向吸收性肠上皮细胞/结肠细胞表型成熟后，通过多种协同机制显著增强防御能力：肌动蛋白调节网络的重编程限制了病原体诱导的膜皱褶形成；顶端表面糖萼（特别是膜结合黏蛋白）的积累建立了物理屏障；对SipA效应蛋白依赖性的增加反映了入侵机制的适应性转变。

这项研究的重要意义在于填补了简化细胞模型与复杂体内环境之间的知识空白，提供了在生理相关人类模型系统中实时观察病原体-宿主相互作用的技术平台。研究结果不仅解释了为什么传统细胞系实验与体内观察存在差异，还为理解不同生理状态（如发育阶段、炎症条件）下肠道感染易感性的变化提供了机制基础。此外，该资源平台为未来系统性重建人类肠道感染生态位、深入研究宿主防御机制和病原体适应策略奠定了重要基础。