工程化血管化骨内膜生态位模型：人iPSC来源的3D骨髓生态位构建与功能解析

《Cell Stem Cell》：Macro-scale, scaffold-assisted model of the human bone marrow endosteal niche using hiPSC-vascularized osteoblastic organoids

本研究针对人骨髓骨内膜生态位（endosteal niche）体外建模难题，开发了基于hiPSC（人诱导多能干细胞）与羟基磷灰石支架的宏尺度工程化血管化骨内膜生态位（eVON）模型。该模型成功复现了人骨内膜生态位的细胞组成（如血管网络、周细胞、神经纤维）与关键分子信号（CXCL12、KITLG/SCF、VEGFA），并证明其可支持造血干细胞/祖细胞（HSPC）的体外维持及体内多系重建能力。通过扰动血管结构及信号通路（如VEGF-A、CXCL12），揭示了内皮血管对髓系分化的调控作用，为研究人血液疾病（如急性髓系白血病AML）提供了标准化、全人源化的实验平台。

　　

骨髓作为人体重要的造血器官，其功能依赖于复杂的微环境——骨髓生态位（bone marrow niche）。其中，位于骨内膜附近的“骨内膜生态位”（endosteal niche）对造血干细胞/祖细胞（HSPC）的维持、分化及应激造血过程至关重要。然而，由于人源组织的稀缺性与伦理限制，该生态位的细胞组成与分子调控机制长期以来主要依赖小鼠模型研究，其在人体内的真实特征与功能仍不明确。此外，现有基于hiPSC（人诱导多能干细胞）的骨髓类器官模型缺乏骨组织成分，且尺度微小，难以模拟生理条件下的血管结构，限制了其在疾病建模与药物筛选中的应用。

为解决上述问题，瑞士巴塞尔大学医院的研究团队在《Cell Stem Cell》发表了一项创新性研究，通过结合hiPSC分化技术与宏尺度羟基磷灰石支架，成功构建了名为“工程化血管化骨内膜生态位”（engineered vascularized osteoblastic niche, eVON）的3D全人源化模型。该模型不仅复现了人骨内膜生态位的细胞多样性（如血管内皮细胞、周细胞、神经细胞及巨噬样细胞），还表达了关键生态位因子（如CXCL12、KITLG/SCF、VEGFA），并能够长期支持HSPC的功能维持。

研究团队首先通过时序诱导hiPSC分化为血管定向类器官（vascular fate organoids）与成骨定向类器官（osteoblastic fate organoids），并将其依次接种于仿骨结构的羟基磷灰石支架中，在无血清、无动物源成分的培养基中培养33天形成成熟eVON。关键技术包括：hiPSC的3D类器官分化、支架辅助的宏尺度组织构建、流式细胞术与单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析、免疫荧光成像与扫描电镜（SEM）观察、以及体内移植实验（将eVON植入免疫缺陷小鼠皮下或提取其HSPC进行移植）。所用脐带血来源CD34⁺ HSPC来自巴塞尔大学医院健康捐赠者。

eVON复现人骨内膜生态位的关键特征

通过流式细胞术与高分辨率成像分析，eVON中检测到CD31⁺内皮细胞（1%-2%）、CD146⁺及CD271⁺间充质细胞（60%-40%），而缺乏血管的对照模型（eON）则无内皮细胞。免疫荧光显示eVON内形成CD34⁺/CD31⁺血管网络，覆盖NG2⁺周细胞，并整合于骨钙素（OCN）阳性成骨基质中。扫描电镜进一步揭示血管具窗孔结构，直径5-30μm，类似小鼠骨内膜小动脉。

骨内膜血管增强人髓系造血

将脐带血CD34⁺ HSPC与eVON/eON共培养7天后，eVON显著促进HSPC（尤其是多能祖细胞MPP）和CD33⁺髓系祖细胞扩增，而eON更倾向支持淋巴系与非髓系细胞。体内移植实验证实eVON中HSPC可重建免疫缺陷小鼠的多系造血（髓系、巨核系、B/T细胞），且CXCL12-CXCR4信号通路的抑制（使用AMD3100）或生长因子（SCF/TPO/FLT3L）撤除会损害HSPC维持，表明eVON中生态位信号功能活跃。

eVON的体内稳定性与细胞多样性

eVON植入小鼠皮下6周后仍保持完整结构，含人源与鼠源嵌合血管，且hiPSC来源的基质细胞（包括内皮细胞与周细胞）持续存在。scRNA-seq分析揭示eVON包含12个细胞簇，除成骨细胞、内皮细胞、周细胞外，还有神经细胞（表达TH）、巨噬样细胞（表达CD68）等意外群体，进一步模拟了天然生态位的复杂性。

不同hiPSC来源eVON的造血支持特性

使用WTC、Wibj、409B2三种hiPSC系构建的eVON均支持造血，但WTC-eVON最利于HSPC维持，而Wibj-eVON促进巨核系分化。分子分析显示CXCL12主要由间充质细胞（C2、C7簇）表达，KITLG/SCF主要在内皮细胞（C11簇）表达，提示人生态位信号的细胞来源具有物种特异性。

VEGF-A信号调控血管形态

通过调控VEGF-A剂量（0-500 ng/mL）或使用抑制剂（Avastin），发现内源性VEGF-A是维持eVON血管网络的关键，高剂量VEGF-A诱导血管畸形（类似血管瘤），而抑制NOTCH信号则完全破坏血管结构，证明eVON可用于病理状态建模。

本研究开发的eVON模型首次在全人源、宏尺度条件下复现了骨内膜生态位的结构与功能完整性，不仅为研究生理性造血提供了新平台，更可通过基因编辑与信号扰动模拟血液恶性肿瘤（如AML）的生态位异常。其标准化、可定制化特性有望推动个体化疾病建模与药物筛选，突破传统动物模型的物种局限性。