杨树果胶酸裂酶PtxtPL1-27异位表达通过破坏同型半乳糖醛酸聚糖调控叶片角质层发育的机制研究

《iScience》：Ectopic expression of pectate lyase PtxtPL1-27 in aspen affects leaf cuticle development

本研究针对植物疏水性角质层前体如何穿越亲水性细胞壁这一关键科学问题，通过异位过表达果胶酸裂酶PtxtPL1-27破坏杨树叶片中同型半乳糖醛酸聚糖（HG）的完整性，发现HG结构紊乱导致角质层厚度显著减少、成分改变，并首次揭示HG通过影响角质体（cutinsome）介导的角质单体运输与聚合途径调控角质层发育。该成果发表于《iScience》，为植物表皮屏障形成机制提供了新视角。

　　

植物叶片表面的角质层是覆盖在表皮细胞外壁的疏水屏障，由角质和蜡质组成，能帮助植物在陆地环境中抵抗生物和非生物胁迫，并调节气体交换。然而，疏水的角质层前体如何穿越富含亲水性同型半乳糖醛酸聚糖（Homogalacturonan, HG）的细胞壁，一直是个未解之谜。此前有假说认为，自组装形成的纳米结构“角质体”（cutinsome）可能负责运输并聚合角质单体，而HG可能与角质体的外壳形成有关，但HG在角质层发育中的具体作用尚未得到实验证实。

为了阐明HG在角质层形成中的作用，研究人员在杨树（Populus tremula × tremuloides）中异位过表达了一个果胶酸裂酶（pectate lyase, PEL）基因 PtxtPL1-27，以特异性破坏HG的完整性。他们选取了两个转基因株系（1002和1051），其PEL酶活性比野生型（WT）高8至11倍。研究发现，过表达PtxtPL1-27对杨树的地上部分发育产生了多效性影响：株高降低、节间缩短、叶片发育加速，同时叶片表皮细胞形状改变、细胞间空隙增大、气孔功能受损。更重要的是，转基因植株成熟叶片的角质层厚度显著减少，角质和蜡质成分发生变化，但角质生物合成关键基因的表达并未受到明显抑制。

为了开展此项研究，作者运用了多种关键技术方法：利用杨树遗传转化体系获得过表达PtxtPL1-27的转基因植株；通过细胞壁多糖顺序提取、糖组成分析和糖基连接分析、以及基于150种单克隆抗体的糖组图谱（glycome profiling）技术，全面解析了细胞壁多糖（特别是HG）的含量和提取性变化；采用免疫电镜技术定位细胞壁中的HG和木葡聚糖（xyloglucan）表位；通过透射电镜观察角质层和细胞壁超微结构，并结合ATR-FTIR光谱分析表皮表面的化学组成；利用非靶向代谢组学（LC-MS）分析角质降解产物，并通过GC-MS分析蜡质成分；最后通过qPCR检测角质生物合成相关基因的表达。

研究结果

过表达果胶酸裂酶PtxtPL1-27诱导了枝条的主要发育变化并影响角质层功能

转基因植株表现出株高降低、节间缩短和数量减少、叶片发育加速等表型。气孔孔径增大且关闭功能受损，导致蒸腾速率和光合速率升高。角质层渗透性略有增加。

果胶酸裂酶PtxtPL1-27降低了叶片果胶含量并增加了多糖基质的可提取性

细胞壁分析表明，转基因植株叶片中HG和阿拉伯聚糖（arabinan）含量下降，而木聚糖（xylan）和木葡聚糖的可提取性增加。糖组图谱证实了HG和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I（RGI）骨架表位信号的减弱。

果胶酸裂酶PtxtPL1-27影响表皮细胞外壁中果胶和木葡聚糖表位的分布

免疫电镜显示，转基因植株表皮细胞外壁中识别低甲酯化HG的JIM5抗体标记信号密度增加了五倍以上，且分布模式改变；而识别岩藻糖基化木葡聚糖的CCRC-M1信号则显著减少。

果胶酸裂酶PtxtPL1-27显著降低角质层厚度并减少角质沉积

光学显微镜和透射电镜观察发现，转基因植株角质层及其内侧的角质-碳水化合物层厚度急剧减少。ATR-FTIR光谱显示与角质和蜡质相关的特征峰强度降低，表明表皮表面角质沉积减少。

过表达果胶酸裂酶PtxtPL1-27影响角质和蜡质组成

非靶向代谢组学分析发现，典型的C16和C18羟基脂肪酸等角质单体含量下降，而较长链的羟基脂肪酸（可能来自木栓质）增加。蜡质分析表明，水杨酸衍生物减少，而长链醛、烷基酯和醇类成分增加。

过表达果胶酸裂酶PtxtPL1-27对角质层生物合成途径基因表达影响甚微

对8个角质生物合成关键基因的qPCR分析显示，只有长链酰基辅酶A合成酶基因LACS1轻微下调，ABC转运蛋白基因ABCG32轻微上调，未发现PEL活性导致整个通路基因表达的协同下调。

果胶酸裂酶PtxtPL1-27增加了转基因植株表皮外壁的脂质含量

电镜超微结构观察发现，转基因植株表皮细胞壁与角质层相邻的区域被铅柠檬酸染色的脂质层更宽、颜色更深，而电子透明包涵体（可能含聚合角质）变小。抗角质体抗体标记信号在转基因植株中更为稀少。PATAg染色显示转基因植株细胞壁中多糖分布改变，角质层内侧标记减少。

本研究通过破坏HG的完整性，首次提供了HG在角质层发育中起关键作用的直接证据。研究人员提出，PtxtPL1-27通过降解HG，干扰了角质体外壳的形成，从而影响了角质单体通过细胞壁的运输及其在细胞壁-角质层 continuum 中的聚合过程，最终导致角质层变薄和成分改变。尽管异位表达PEL会产生多效性效应，但实验数据一致支持HG完整性、角质体功能与角质层正常发育之间的密切联系。该研究不仅深化了对植物表皮屏障形成机制的理解，也为通过调控细胞壁多糖代谢来改良植物抗逆性提供了新的思路。研究成果发表于《iScience》杂志。