唾液酸聚糖调控Siglec-5-TLR4相互作用在骨关节炎中的作用机制研究

《iScience》：Sialoglycans modulate Siglec-5-TLR4 interactions in osteoarthritis

本研究针对骨关节炎（OA）中慢性低度炎症调控机制不明的难题，通过纳米颗粒富集技术发现OA滑液中高表达的Siglec-5/14与TLR4存在相互作用。研究团队利用患者滑液刺激单核细胞，结合流式细胞术、免疫荧光染色及细胞因子检测，首次揭示Siglec-5通过依赖唾液酸聚糖的机制负向调控TLR4信号通路，抑制IL-6等促炎因子释放。该发现为OA的免疫代谢调控提供了新靶点，为开发以糖基化修饰为核心的抗炎策略奠定理论基础。

　　

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）作为一种常见的退行性关节疾病，严重影响患者的生活质量。其病理特征包括滑膜炎、软骨降解和软骨下骨重塑，而慢性低度炎症是推动疾病进展的核心因素。尽管OA与机械应力及炎症通路密切相关，但患者之间存在显著的异质性，使得治疗策略的制定充满挑战。目前的治疗方法，如针对白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的临床试验，疗效有限，凸显了对OA发病机制中新型调控环节的迫切需求。

在此背景下，研究人员将目光投向了免疫调节受体家族——唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）。此前，通过纳米颗粒（NPs）与OA患者滑液（SF）共孵育并进行蛋白质组学分析，意外发现Siglec-5/14是富集程度最高的蛋白之一。这提示Siglec-5/14可能在OA病理中扮演重要角色。尤其值得注意的是，TLR4（Toll样受体4）是OA炎症反应的关键驱动因子，可被软骨碎片等损伤相关分子模式（DAMPs）激活，但其调控机制尚不明确。本研究旨在探索Siglec-5与TLR4在OA中的相互作用，以期揭示新的免疫调节通路。

为了回答上述问题，研究团队开展了一系列实验。他们首先从健康捐赠者血液中分离单核细胞，并用OA滑液进行刺激，通过流式细胞术分析细胞表面标志物的表达变化。结果显示，OA滑液能够诱导单核细胞向中间亚群（CD14⁺CD16⁺）分化，并显著上调Siglec-5的表达，而TLR4的表达则呈下降趋势，二者呈现负相关。为进一步验证Siglec-5对TLR4信号的调控作用，研究人员使用M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）、LPS（脂多糖）和唾液酸酶等刺激因子处理单核细胞，并利用TLR4抑制剂TAK-242和SHP-1抑制剂TPI-1进行干预。通过免疫荧光染色和共定位分析，发现Siglec-5与TLR4在细胞膜上存在物理相互作用，且该相互作用依赖于唾液酸聚糖的完整性。当细胞被唾液酸酶处理后，二者共定位显著减弱，同时促炎因子如IL-6、TNF-α的分泌增加。最后，通过聚类分析（UMAP）将不同刺激条件下的单核细胞表型与细胞因子谱关联，发现高炎症表型（如LPS和唾液酸酶处理）与部分OA患者滑液诱导的表型相似，提示患者间炎症水平的异质性可能与Siglec-5-TLR4轴的调控状态有关。

本研究的关键技术方法包括：利用纳米颗粒富集滑液蛋白并进行质谱分析；通过流式细胞术检测单核细胞亚群及表面受体表达；采用免疫荧光和共定位分析研究受体相互作用；使用细胞因子芯片和ELISA评估炎症因子水平；借助聚类算法（如FlowSOM和UMAP）对细胞表型进行无监督分析。实验所用滑液样本来源于接受膝关节置换术的OA患者（年龄63–87岁），单核细胞来自健康捐赠者的血液。

Siglec-5/14可在OA患者滑液中发现，且膜相关Siglec-5/14与单核细胞上TLR4表达呈负相关

通过纳米颗粒富集技术，研究人员在OA滑液中鉴定出Siglec-5/14为高丰度蛋白。进一步利用IntAct数据库预测发现，Siglec-5与TLR4存在中等置信度的相互作用。流式细胞术分析显示，OA滑液刺激后单核细胞中Siglec-5表达上调，而TLR4表达下降，且中间单核细胞亚群比例显著增加，提示Siglec-5可能通过调控TLR4影响单核细胞极化。

Siglec-5作为TLR4信号通路的潜在调节因子在炎症中发挥作用

为明确Siglec-5在TLR4信号通路中的角色，研究人员用M-CSF、LPS等刺激单核细胞，发现LPS可快速降低TLR4表达，而Siglec-5在24小时后恢复至基线水平。抑制SHP-1后，LPS诱导的IL-6、IL-8等细胞因子分泌增加，表明Siglec-5可能通过招募SHP-1负向调控TLR4信号。

Siglec-5与TLR4在单核细胞膜上共定位

通过免疫荧光染色和共定位系数（MCC）计算，发现Siglec-5与TLR4在静息单核细胞膜上存在较强重叠（MCC=0.78），而LPS或唾液酸酶处理后可显著降低共定位水平，说明炎症刺激破坏二者相互作用。

细胞内抑制TLR4可减少细胞因子分泌并降低Siglec-5表达

使用TLR4抑制剂TAK-242处理后，LPS和M-CSF诱导的炎症因子（如TNF-α、IL-1β）分泌显著抑制，同时Siglec-5表达下降，进一步证实TLR4信号与Siglec-5之间存在反馈调节。

Siglec-5与TLR4的相互作用因唾液酸聚糖的缺失而被破坏

唾液酸酶处理去除细胞表面唾液酸后，TLR4与Siglec-5的共定位几乎消失，且促炎因子分泌模式与LPS刺激高度相似，表明唾液酸聚糖是维持Siglec-5-TLR4相互作用的关键。

IL-6分泌水平可与不同的单核细胞表型相关联

通过UMAP聚类分析，将单核细胞分为6个亚群，其中高炎症表型（如Pop3、Pop5）与LPS或唾液酸酶处理组重叠，且与OA患者中IL-6高水平分泌相关，提示Siglec-5-TLR4轴的失调可能导致OA炎症异质性。

综上所述，本研究首次揭示Siglec-5通过唾液酸聚糖依赖的方式调控TLR4信号，在OA中发挥免疫抑制作用。这一发现不仅深化了对OA炎症调控机制的理解，也为开发针对Siglec-5及相关糖基化修饰的靶向治疗提供了新思路。未来研究可进一步探索Siglec-5在OA患者不同炎症亚型中的表达差异，以及其在软骨细胞和滑膜细胞中的潜在作用，为精准医疗提供理论依据。