核糖核苷酸还原酶亚基M2通过mTOR通路招募弗林蛋白酶调控登革热病毒成熟的新机制

《iScience》：Ribonucleotide reductase subunit M2 mediates the mTOR pathway to recruit furin endoprotease and promote maturation of dengue virus

本刊推荐：为解决登革热病毒成熟机制不清的问题，研究人员开展了RRM2通过mTOR通路调控弗林蛋白酶介导的病毒prM蛋白切割机制研究。结果表明，RRM2沉默导致furin表达下降、prM切割受阻，而mTOR过表达可逆转此效应。该发现揭示了宿主因子RRM2在黄病毒成熟过程中的关键作用，为广谱抗病毒策略提供了新靶点。

　　

随着全球气候变暖，蚊媒病毒性疾病呈现爆发式增长，其中登革热病毒(DENV)每年感染数亿人口，成为热带和亚热带地区的重大公共卫生威胁。登革热病毒属于黄病毒科，其成熟过程需要宿主细胞蛋白酶对病毒前体膜蛋白(prM)进行切割，这一关键步骤决定了病毒粒子的感染性。然而，宿主因子如何精确调控这一成熟过程的分子机制尚不明确，这限制了针对病毒成熟环节的广谱抗病毒策略的开发。

在《iScience》最新发表的研究中，日本鹿儿岛大学和东京都医学研究所的Bouchra Kitab、Michinori Kohara和Kyoko Tsukiyama-Kohara团队发现，核糖核苷酸还原酶小亚基M2(RRM2)通过mTOR信号通路调控弗林蛋白酶(furin)的稳定性，进而影响登革热病毒的成熟过程。该研究不仅揭示了RRM2在RNA病毒生命周期中的新功能，更为理解宿主-病毒相互作用提供了新的分子视角。

研究人员采用多种关键技术方法开展研究：通过siRNA基因沉默技术在人肝癌细胞系(HuH-7、HepG2)和肺腺癌细胞系(A549)中敲低RRM2表达；利用免疫共沉淀和免疫荧光共定位分析RRM2与furin的相互作用；采用蛋白质稳定性实验（环己酰亚胺追踪实验）评估furin的半衰期；通过AG129基因敲除小鼠模型进行体内验证；使用AlphaFold3多聚体预测蛋白质相互作用结构；并运用mTOR通路抑制剂（雷帕霉素）和过表达实验验证信号通路机制。

RRM2是病毒成熟和释放的必要条件

研究人员首先通过siRNA沉默RRM2表达，发现在DENV-1和DENV-2感染的多种人源细胞系中，RRM2敲低导致细胞内病毒RNA积累增加，而细胞外感染性病毒滴度显著降低。聚焦斑块实验显示，RRM2沉默细胞的培养上清中感染性病毒数量减少，而细胞活性实验证实这种效应并非由siRNA毒性引起。免疫荧光分析进一步表明，从RRM2沉默细胞收集的培养上清感染幼稚细胞后，病毒囊膜蛋白(E)表达明显减弱，证明RRM2确实影响了感染性病毒粒子的释放。

RRM2影响弗林蛋白酶调控DENV prM蛋白切割

进一步机制研究表明，DENV感染虽不改变RRM2 mRNA水平，但显著提高了RRM2蛋白表达。Western blot分析显示，RRM2沉默导致DENV结构蛋白（衣壳、prM和E）在细胞内大量积累。特别值得注意的是，prM与E蛋白的比例在RRM2沉默细胞中显著升高，表明prM蛋白切割受阻。对培养上清中pr片段的检测发现，RRM2沉默细胞中pr片段含量减少，证实病毒成熟过程受损。研究人员还发现RRM2沉默影响了DENV E蛋白的糖基化状态，并增强了E蛋白在高尔基体和TGN中的定位。

关键的是，RRM2沉默显著降低了furin蛋白水平，而不影响其mRNA表达。即使在furin过表达条件下，RRM2沉默仍能降低furin蛋白水平并增加prM积累，表明RRM2在翻译后水平调控furin稳定性。

DENV感染促进RRM2-furin相互作用

免疫共沉淀实验证实，在DENV感染条件下，RRM2与furin存在特异性相互作用。免疫荧光分析显示，DENV感染使RRM2与furin的共定位显著增强（皮尔逊相关系数从0.78升至0.91）。在AG129小鼠感染模型中，肝脏组织免疫共沉淀进一步验证了RRM2与furin的体内相互作用，且DENV感染增强了这种相互作用。AlphaFold3多聚体结构预测模型支持了RRM2与furin之间存在直接相互作用的可能性。

RRM2表达对furin蛋白稳定性至关重要

环己酰亚胺追踪实验表明，RRM2过表达能显著增强furin蛋白稳定性。蛋白酶体和溶酶体抑制剂处理实验排除了RRM2通过这两种降解途径调控furin的可能性，提示存在其他调控机制。

RRM2-mTOR通路调控DENV成熟过程

研究发现mTOR抑制剂雷帕霉素处理能剂量依赖性地降低RRM2和furin蛋白水平。RRM2沉默与雷帕霉素处理具有协同效应，共同降低furin水平并增加prM积累。相反，mTOR过表达能逆转RRM2沉默引起的furin下降和prM积累，同时降低细胞内病毒RNA水平。机制上，mTOR过表达降低了4E-BP1（真核翻译起始因子4E结合蛋白1）的表达，表明mTOR-4E-BP1信号通路参与调控furin稳定性。

研究结论与意义

该研究揭示了一个精细调控的DENV成熟机制：在病毒感染过程中，RRM2通过mTOR信号通路稳定furin蛋白，促进prM蛋白的正确切割，从而产生成熟的感染性病毒粒子。相反，RRM2沉默会通过mTOR/4E-BP1依赖性途径促进furin降解，导致未切割prM积累和病毒成熟受阻。

这一发现的重要意义在于：首次阐明了RRM2在RNA病毒成熟过程中的关键作用，拓展了人们对核糖核苷酸还原酶功能的认识；揭示了mTOR-RRM2-furin轴在病毒成熟中的精细调控机制；为开发针对病毒成熟过程的广谱抗病毒策略提供了新靶点。鉴于furin在多种病毒（如HIV-1、禽流感病毒、HBV和SARS-CoV-2）糖蛋白切割中的普遍作用，靶向RRM2可能成为应对多种病毒感染的潜在治疗策略。

该研究的局限性在于尚未在其他黄病毒中验证RRM2对furin表达和prM切割的影响，这将是未来研究的重要方向。总体而言，这项研究深化了对病毒-宿主相互作用的理解，为抗病毒药物研发提供了新的理论基础和潜在靶点。