小鼠红细胞蛋白质组遗传架构揭示血红蛋白β半胱氨酸93在维持氧化还原平衡中的核心作用

《Cell Genomics》：Genetic architecture of the murine red blood cell proteome reveals central role of hemoglobin beta cysteine 93 in maintaining redox balance

本研究针对红细胞在储存和输血过程中功能下降的难题，通过构建350只遗传多样性小鼠模型，首次绘制了红细胞蛋白质组的定量性状位点图谱。研究人员发现转作用QTL热点主导蛋白质组调控，并揭示血红蛋白β链Cys93作为关键的氧化还原调节枢纽，与STEAP3介导的铁代谢共同构成调控红细胞氧化应激和溶血的新通路。这项工作为输血医学和溶血性疾病提供了重要的遗传学和生化机制见解。

　　

在我们身体的血液循环系统中，红细胞是数量最庞大的细胞类型，约占循环细胞的99%。这些无核细胞承担着氧气运输的重任，但同时也面临着巨大的氧化应激挑战。从氧气充足的肺部（pO₂约100 mmHg）到氧气稀薄的外周毛细血管（pO₂仅20-40 mmHg），红细胞在不断循环过程中积累氧化损伤，导致功能逐渐下降。这一问题在输血医学中尤为突出——冷藏储存的血制品会随时间推移出现“储存损伤”，影响输血效果。

红细胞之所以容易受到氧化损伤，与其特殊的生物学特性密切相关。成熟红细胞缺乏细胞核和细胞器，无法合成新的蛋白质来替换受损组分。每个红细胞含有约2.5-2.7亿个血红蛋白分子，占细胞总蛋白的98%左右。血红蛋白在自动氧化过程中每天产生大量超氧化物，这些活性氧分子会攻击细胞内的蛋白质和脂质，破坏红细胞的结构和功能。

为了深入探索红细胞抵抗氧化损伤的遗传基础，由Gregory R. Keele、Angelo D'Alessandro和James C. Zimring等领导的研究团队进行了一项开创性研究。他们利用350只遗传多样性小鼠（Diversity Outbred mice）模型，系统分析了新鲜和储存红细胞的蛋白质组、代谢组和脂质组，绘制了首张全面的小鼠红细胞蛋白质组定量性状位点（QTL）图谱。这项研究发表于《Cell Genomics》杂志，揭示了血红蛋白β链半胱氨酸93（Cys93）在维持红细胞氧化还原平衡中的核心作用。

研究团队采用了一系列先进的技术方法，包括遗传多样性小鼠模型（J:DO）的建立、数据非依赖采集（DIA）质谱技术进行蛋白质组学分析、定量性状位点（QTL）作图、多组学因子分析（MOFA），以及人源化HBB基因编辑小鼠模型的构建和验证。这些技术的综合应用使研究人员能够从遗传变异到分子表型进行全面解析。

Profiling the murine RBC proteome

研究人员首先对350只J:DO小鼠的新鲜和储存红细胞进行了全面的蛋白质组分析，共定量了20,031条肽段，代表2,350种蛋白质，以及11,231条带有20种不同翻译后修饰（PTM）的肽段。结果显示，储存显著改变了红细胞的蛋白质组特征，共鉴定出669个储存响应蛋白（错误发现率FDR < 0.05），其中399个在新鲜样本中含量较高，270个在储存样本中含量较高。新鲜样本富含免疫相关蛋白和蛋白酶抑制因子，而储存样本则富含蛋白酶体和蛋白酶成分，表明蛋白质降解在储存损伤中发挥重要作用。

Genetic mapping of the RBC proteome

遗传作图分析揭示了红细胞蛋白质组的独特遗传架构。研究人员共定位了954个蛋白质QTL（pQTL，165个顺式、764个反式）和1,002个储存特异性pQTL，以及4,603个肽段QTL（pepQTL）和5,198个储存特异性pepQTL。与其它组织不同，红细胞中反式QTL的数量是顺式QTL的5-7倍，这一特征反映了无核红细胞缺乏新蛋白质合成的生物学特性。

QTL hotspots highlight key genes for RBC function and metabolism

研究发现红细胞反式pQTL集中在四个主要热点区域：三个在新鲜和储存红细胞中均存在（染色体7:120 Mbp，染色体9:107 Mbp，染色体11:33 Mbp），一个为储存特异性（染色体1:119 Mbp）。这些热点区域编码的关键基因包括Steap3（染色体1）、Hbb（染色体7）、Mon1a（染色体9）和Hba（染色体11）。多组学因子分析显示，这些热点共同构成了调控红细胞分子表型变异的主要网络。

Steap3 regulates APOs as part of its role in storage lesion moderation and ferroptosis

Steap3作为一种铁还原酶，被确认为输血后恢复（PTR）的主要驱动因子。研究发现STEAP3蛋白表达与PTR呈负相关，高表达STEAP3的等位基因与较强的铁还原能力相关，进而促进成熟储存红细胞中的芬顿化学反应。位于Steap3位点的转运QTL热点包含多个参与囊泡化过程的载脂蛋白（APOs），这些蛋白的表达水平与PTR密切相关。

Hemoglobin and Mon1a trans-regulate proteasome components

HBA和HBB链的pQTL、pepQTL和ptmQTL主要定位在染色体1热点，将Steap3与染色体7和11的血红蛋白QTL热点联系起来。三个热点共同调控的18个蛋白质显著富集于蛋白酶体成分和蛋白质降解相关蛋白，突出了蛋白质降解在缓解红细胞氧化应激中的重要性。

Hbb QTL hotspot driven by a novel cysteine variant

研究发现Hbb热点主要由一个新颖的半胱氨酸变异驱动。部分J:DO创始品系（AJ、129、CAST、PWK、WSB）的Hbb-bt仅有一个半胱氨酸残基（Cys93），与人类HBB基因相似，而其他品系（B6、NOD、NZO）则拥有第二个半胱氨酸（Cys13）。这一遗传变异是Hbb热点反式QTL的主要驱动因素。

HBA and HBB chains act as primary PTM hubs in RBCs

分层分析ptmQTL发现，氧化和脱酰胺是主要映射到Hbb和Hba热点的PTM类型。HBA和HBB链肽段占据了非氧化和脱酰胺ptmQTL的很大比例，表明血红蛋白变异对红细胞具有广泛影响。特别值得注意的是，泛素化肽段的ptmQTL也富集于相同的Hbb和Hba热点，表明这些区域参与调控储存损伤蛋白的蛋白酶体降解。

Humanized Hbb mouse model

为验证Hbb对红细胞蛋白质组和代谢组的影响，研究人员构建了Hbb半胱氨酸修饰的基因工程小鼠模型。实验比较了三组小鼠：B6野生型（WT，HBB-BS仅有Cys93）、表达人源典型HBB（仅有Cys93）的人源化小鼠，以及表达HBB C93A（Cys93Ala）突变的人源化小鼠。结果显示，两种人源化品系的PTR均显著下降，但只有C93A小鼠表现出细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）水平降低。蛋白质组学分析证实了C93A小鼠中C93含肽段的缺失，以及由于C93缺失导致的蛋白质组和谷胱甘肽化肽段的广泛变化。

这项研究首次全面揭示了红细胞蛋白质组的遗传架构，并确立了血红蛋白βCys93在维持氧化还原平衡中的核心地位。研究结果表明，红细胞不同于其他组织，其蛋白质组受到强烈的反式遗传调控，特别是在Hba、Hbb和Mon1a基因座热点区域。HBB水平和其半胱氨酸残基不仅是简单的谷胱甘肽缓冲剂，更是细胞内氧化还原稳态的主要调节因子。

研究的创新之处在于发现了一个先前未被认识的、遗传编码的氧化还原代谢回路，将STEAP3和HBB联系起来。这一回路中，储存相关的铁代谢、氧化还原缓冲、蛋白质修复和囊泡化过程被动态协调，共同决定红细胞在储存过程中的韧性。具体而言，STEAP3依赖的铁还原和铁驱动的氧化应激、血红蛋白巯基状态调节的谷胱甘肽池可用性、保守的Cys93氧化还原状态、蛋白酶体依赖性清除氧化蛋白以及囊泡化途径共同构成了一个深度整合的网络。

这些发现不仅对输血医学具有重要启示，为改善血制品储存质量提供了新靶点，而且对理解镰状细胞病、β地中海贫血等溶血性疾病的发病机制提供了新视角。研究建立的综合红细胞资源库为未来红细胞研究提供了独特平台，有助于推动血液学领域的进一步发展。

尽管该研究存在一些局限性，如小鼠模型与人类生理差异、统计功效限制等，但其开创性的研究方法和系统性的分析结果为红细胞生物学领域奠定了重要基础。未来研究可在此基础上进一步探索其他候选位点和PTM的机制作用，并在人类供体中进行纵向验证，最终实现红细胞储存质量和输血疗效的精准提升。