基于电化学检测的流动注射生物测定平台用于丙酮酸的测定：高效固定化酶反应器的开发

《Analytica Chimica Acta》：Flow injection bioassay platform with electrochemical detection for pyruvate determination: Development of highly efficient immobilized enzyme reactors

本研究开发了一种基于固定化酶反应器（IMER）的电化学流注射生物传感器系统，采用mPOx酶实现高灵敏度和稳定性检测（检测限11μM），适用于临床诊断和食品发酵过程监控，解决了传统酶法存在的成本高、易失活等问题。

　　这项研究提出了一种新型的电化学流动注射生物测定系统，用于高效、精准地检测丙酮酸。丙酮酸是糖酵解的最终产物，不仅在医学领域具有重要价值，还广泛应用于食品工业中，特别是在发酵食品和饮料的生产过程中。由于丙酮酸的水平变化可能与多种疾病相关，如慢性阻塞性肺病、肥胖、糖尿病、神经退行性疾病、自闭症谱系障碍、心力衰竭、肝病、胃肠道疾病以及癌症，因此其检测对于临床诊断具有重要意义。此外，在人类辅助生殖技术中，丙酮酸水平也被用作评估胚胎活力的重要指标。

当前，丙酮酸的检测方法主要包括分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）以及毛细管电泳法等。然而，这些方法在实际应用中可能存在一定的局限性，如操作复杂、成本较高或检测时间较长。相比之下，基于酶的生物测定方法因其高选择性和灵敏度而备受关注，尤其是在检测丙酮酸时。常用的生物测定酶包括丙酮酸氧化酶（POx）和乳酸脱氢酶（LDH）。尽管LDH在某些情况下能够用于丙酮酸检测，但其应用仍面临一些挑战，例如需要昂贵的辅因子（如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH），且NADH本身不稳定，容易产生抑制LDH活性的副产物。此外，LDH的逆向反应特性可能导致乳酸浓度的干扰，从而影响检测的准确性。

基于上述问题，研究团队开发了一种基于丙酮酸氧化酶（POx）的新型电化学流动注射生物测定系统。该系统采用固定化酶反应器（IMER）技术，将POx固定在特定的载体上，以提高其稳定性和可重复使用性。在固定化过程中，研究团队比较了两种不同的固定化方法：共价键合法（将POx共价结合到氨基功能化的介孔二氧化硅粉末SBA-15上）和物理吸附法（将POx吸附到介孔碳粉末Starbon@300上）。结果显示，无论是哪种固定化方法，使用来自微生物的POx（mPOx）作为酶源都表现出优异的性能。mPOx的固定化量达到约620 μg/IMER，酶的流失率仅为1.7%，表明其具有良好的固定效果和稳定性。此外，该固定化系统在储存稳定性方面表现出色，能够在6个月内保持高效性能，并且可重复使用400次以上，无需对工作电极进行钝化处理。

为了进一步提高检测的灵敏度和选择性，研究团队还探讨了基于酶底物循环的信号放大策略。这一策略的核心在于利用两种酶的协同作用，使一种酶的产物成为另一种酶的底物，从而形成一个循环反应链。例如，在丙酮酸检测中，可以使用LDH和LOx的组合，其中LDH将丙酮酸转化为乳酸，而LOx则将乳酸重新转化为丙酮酸，这一过程伴随着氧气的消耗和过氧化氢的生成。通过这种循环机制，可以显著增强检测信号，提高灵敏度。然而，这种方法也存在一些挑战，如过氧化氢的电化学检测可能受到NADH的干扰，因此需要额外的措施，如使用过氧化氢酶或添加媒介物，以降低检测电位或屏蔽NADH的干扰。

在本研究中，团队选择了电化学检测方法，利用银汞合金丝网印刷电极监测氧气的消耗。这种方法避免了NADH的干扰，提高了检测的稳定性和可靠性。实验结果显示，该生物测定系统能够检测到低至11 μM的丙酮酸，表现出良好的灵敏度。此外，该系统在复杂生物基质中的应用也得到了验证，例如在人类尿液和血浆样本中，以及各种含丙酮酸的食品和饮料中。实验结果表明，该方法的相对回收率在95.5%至104.0%之间，说明其具有较高的准确性和精密度。

在实际应用中，该生物测定系统的可操作性和可重复性是其重要优势。流动注射分析（FIA）技术能够实现快速、高通量和自动化的检测，适用于需要频繁检测的场景。同时，IMER的可替换性使得系统能够轻松切换用于不同分析物的检测，提升了设备的灵活性和实用性。此外，该系统的成本控制也较为理想，每台设备的费用不超过19欧元，这使得其在实际应用中更具可行性。

研究团队还对现有的基于酶底物循环的丙酮酸检测方法进行了评估。他们发现，尽管已有部分研究报道了基于LDH和LOx组合的丙酮酸检测方法，但这些方法在关键性能指标方面仍存在不足。例如，一些研究平台缺乏对储存稳定性、可重复使用性、重复性和再现性的系统评估，这表明在酶底物循环策略的实际应用中仍存在研究空白。此外，现有的检测方法往往依赖于复杂的实验条件和额外的试剂，这可能限制其在实际应用中的推广。

为了弥补这些不足，本研究提出了一个更加简单、稳定且经济的检测方案。通过将POx固定在特定的载体上，并结合电化学检测方法，研究团队成功开发了一种能够有效检测丙酮酸的生物测定平台。该平台不仅具备良好的分析性能，还能够在复杂生物基质中保持高选择性，避免了传统方法中可能存在的干扰问题。同时，其高稳定性和可重复使用性使得该系统在长期使用中能够保持一致性，为临床和食品工业的检测需求提供了可靠的技术支持。

在实验设计方面，研究团队采用了多种材料和方法，以确保检测系统的稳定性和有效性。例如，他们使用了来自不同来源的POx，包括微生物来源的mPOx和来自Aerococcus viridans的AvPOx。通过比较这两种酶的性能，团队发现mPOx在固定化后表现出更优的催化活性和稳定性。此外，研究团队还测试了不同的固定化方法，包括共价键合和物理吸附，以确定哪种方法能够更好地保留酶的活性并减少其流失。

在实际应用中，该生物测定系统被用于分析多种含丙酮酸的食品和饮料，如葡萄酒、啤酒和乳制品。这些样品通常含有较高的乳酸浓度，这可能会影响传统的检测方法。然而，本研究中采用的POx固定化系统表现出良好的抗干扰能力，能够在复杂的基质中准确检测丙酮酸。此外，该系统还被应用于人类尿液和血浆样本的分析，进一步验证了其在临床诊断中的潜力。

研究团队在实验过程中还特别关注了检测方法的可靠性和可重复性。他们发现，使用银汞合金丝网印刷电极进行电化学检测能够有效避免NADH的干扰，从而提高检测的准确性。此外，该电极在长时间使用中不会出现钝化现象，保证了检测结果的一致性。这些特性使得该系统在实际应用中更加稳定和可靠。

总的来说，这项研究为丙酮酸的检测提供了一种新的生物测定方法，该方法结合了固定化酶反应器（IMER）技术和电化学检测策略，具有高灵敏度、高选择性和良好的稳定性。此外，该系统在实际应用中表现出良好的适应性，能够用于复杂生物基质和食品样本的分析。研究团队还指出，未来的研究可以进一步优化固定化方法，提高检测的灵敏度和选择性，同时探索更多的酶组合和检测策略，以满足不同应用场景的需求。这项工作不仅为丙酮酸的检测提供了新的思路，也为其他类似生物分子的检测研究奠定了基础。