某些核黄素转运蛋白2突变体的二聚化方式发生改变：这可能是导致RTD2患者出现内质网应激（UPR）、钙信号传导异常以及线粒体功能障碍的潜在原因

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Altered dimerization of certain riboflavin transporter 2 mutants: a possible source of UPR, altered calcium signalling and mitochondrial derangements in RTD2

本研究探讨RTD2的分子机制，发现RFVT2二聚化异常引发内质网应激、线粒体功能障碍和钙信号紊乱，为神经退行性疾病治疗提供新思路。

　　RTD2，即核黄素转运蛋白缺乏症类型2，是一种罕见的常染色体隐性遗传性神经退行性疾病，其病因与SLC52A2基因的双等位变异有关。SLC52A2基因编码核黄素转运蛋白2（RFVT2），该蛋白在核黄素的运输中起着关键作用，尤其是在大脑组织中。RTD2的临床表现包括进行性听力损失、视神经萎缩、肌肉无力、呼吸问题以及桥脑-脑桥麻痹。目前的治疗方案主要是高剂量核黄素补充疗法，结合抗氧化剂和其他营养补充剂，如辅酶Q10、左旋肉碱、维生素C、维生素E、α-硫辛酸、B族维生素、ω-3脂肪酸（EPA和DHA）以及复合维生素。

在本研究中，我们重点探讨了RTD2的分子机制，特别是RFVT2的二聚化过程以及与之相关的细胞应激反应。通过使用患者特异性模型，我们发现RFVT2在正常情况下以同源二聚体形式存在，而病理性变异显著影响其二聚化能力，这可能进一步引发内质网（ER）应激。这一假设得到了支持，因为我们在患者诱导多能干细胞（iPSC）衍生的运动神经元中观察到了内质网应激标志物BiP的水平升高。类似的发现也在患者来源的成纤维细胞中被证实，同时我们还观察到了线粒体功能障碍和钙信号传导紊乱。

值得注意的是，在这两种细胞模型中均未检测到显著的FAD含量变化，这表明即使在没有FAD缺乏迹象的情况下，蛋白质毒性应激可能仍然是RTD2的重要致病机制。FAD的自荧光和荧光寿命成像显微镜（FLIM）测量进一步支持了患者运动神经元中线粒体功能障碍的存在。这些发现不仅加深了我们对RTD2致病机制的理解，还突显了RFVT2错误折叠、内质网应激以及线粒体功能障碍在该神经退行性疾病中的关键作用。

在引入RTD2的背景信息时，我们需要认识到，这种疾病具有极低的发病率，低于每100万人中1例。它主要由SLC52A2基因的双等位变异引起，该基因编码的RFVT2蛋白在人体中广泛表达，但尤其在大脑和血脑屏障中具有重要作用。血脑屏障中RFVT2的表达具有年龄依赖性，这可能解释了其在不同年龄阶段对疾病表现的影响。RTD2的临床表现多样，包括听力障碍、肌肉无力（主要表现为上肢和轴向肌无力）、呼吸功能受损以及桥脑-脑桥麻痹，这些症状常导致进食和言语困难。此外，视力减退和感觉性步态共济失调也是常见的症状。然而，所有患者在认知能力方面均保持完好。

当前的治疗方案主要包括高剂量核黄素补充，同时结合抗氧化剂和其他营养补充剂，以帮助改善患者的症状。这些补充剂包括辅酶Q10、左旋肉碱、维生素C、维生素E、α-硫辛酸、B族维生素、ω-3脂肪酸（EPA和DHA）以及复合维生素。这些治疗手段在一定程度上能够缓解RTD2患者的临床表现，但其具体的机制仍需进一步研究。

SLC52家族包括三个成员：SLC52A1、SLC52A2和SLC52A3，分别编码RFVT1、RFVT2和RFVT3。这些转运蛋白在不同的组织中具有不同的表达模式和功能特性，这可能解释了它们各自的缺陷所导致的临床表现差异。RFVT2是一种由11个跨膜螺旋组成的445个氨基酸蛋白，这些跨膜螺旋通过细胞内外的连接环相互连接。RFVT2负责运输核黄素，而核黄素及其衍生物——黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN）——是许多黄素酶的关键辅因子，这些黄素酶主要位于线粒体和过氧化物酶体中，参与脂肪酸、碳水化合物、氨基酸、吡哆醇和胆碱的中间和终端能量代谢。

为了评估病理性变异的运输功能，研究人员开发了一种新的方法——蛋白质脂质体运输实验。该实验允许对每个突变体进行单独测试，显示出所有测试的突变体在最大运输速率（Vmax）方面仅略有影响，但在米氏常数（Km）方面显著增加。这一发现可能解释了为什么RTD2患者对核黄素治疗有反应。此外，对RTD2患者来源的成纤维细胞的研究表明，核黄素运输功能的丧失与线粒体功能受损密切相关。当这些细胞在低浓度的核黄素环境中培养时，它们表现出核黄素摄取减少，以及FAD和FMN在细胞内的含量显著下降，同时线粒体电子传递链的复合体I和II活性也受到抑制。

最近的研究强调了细胞能量代谢障碍和细胞骨架破坏在RTD2发病机制中的同时作用。使用iPSC技术建立的患者特异性模型显示，RTD2患者的细胞存在氧化应激现象，包括线粒体和过氧化物酶体功能障碍。这种氧化应激可能进一步导致细胞骨架异常，进而影响RTD2运动神经元的分化能力。此外，关于人类来源的脑U87细胞的研究表明，病理性变异不仅影响运输蛋白的动特性，还可能影响其稳定性、翻译效率以及在细胞内的运输过程，从而导致蛋白质在内质网中滞留。

内质网应激在神经退行性疾病中的作用已被越来越多的研究证实。例如，Singh等人（2024）指出，内质网应激可以激活未折叠蛋白反应（UPR），如果这种反应无法被解决，可能导致细胞凋亡，从而加剧神经退行性疾病的发展。此外，钙信号传导的紊乱，无论其形式如何，都是神经退行性疾病的一个关键特征。最近的研究进一步表明，内质网应激与所谓的“储存操作钙进入”（SOCE）机制之间存在直接联系，这种机制可能对线粒体代谢和动态产生影响。

为了研究FAD在细胞代谢中的行为，我们使用了荧光寿命成像显微镜（FLIM）技术，记录了FAD在培养细胞中的自荧光衰减函数。我们发现，FAD在结合到蛋白质后，其寿命从未结合状态（开放构象）转变为结合状态（封闭构象）。这一变化在RTD2患者来源的iPSC衍生运动神经元中尤为明显。我们还对三名RTD患者的iPSC衍生运动神经元进行了研究，并对一名患者的成纤维细胞进行了分析，以评估内质网应激、钙信号传导紊乱和线粒体功能障碍在RTD2患者中的情况。

通过研究RFVT2的二聚化状态，我们发现重组的RFVT2蛋白以大约100 kDa的分子量存在，形成同源二聚体。这一结果验证了之前由AlphaFold-Multimer预测的RFVT2同源二聚体模型。我们使用了IMAC色谱法对6His标签的RFVT2蛋白进行了纯化，并通过Sarkosyl-SDS-PAGE对纯化后的蛋白进行了分析。实验结果表明，纯化后的6His-RFVT2蛋白在电泳后显示出两个交叉反应的条带，这进一步支持了RFVT2的二聚化特性。

在讨论部分，我们强调了RTD2的临床重要性，以及其复杂的病理机制。尽管RTD2患者表现出严重的神经症状，但他们的认知能力保持完好，这使得该疾病在临床诊断和治疗上具有独特的挑战。我们的研究不仅揭示了RFVT2变异对二聚化的影响，还进一步探讨了这些变化如何导致内质网应激、钙信号传导紊乱和线粒体功能障碍。这些发现为理解RTD2的致病机制提供了新的视角，同时为未来的治疗策略提供了理论支持。

此外，我们还对RTD2患者的成纤维细胞和运动神经元进行了系统的研究，以评估这些细胞在不同条件下的代谢状态和应激反应。实验结果显示，这些细胞在低浓度核黄素环境中表现出明显的代谢异常，包括FAD和FMN的含量下降，以及线粒体电子传递链复合体I和II的活性降低。这些结果进一步支持了RTD2患者中线粒体功能障碍的存在，并表明这种功能障碍可能与内质网应激和钙信号传导紊乱密切相关。

综上所述，本研究通过使用患者特异性模型，揭示了RTD2的分子机制，特别是RFVT2的二聚化过程及其对细胞应激反应的影响。这些发现不仅加深了我们对RTD2致病机制的理解，还为未来的治疗策略提供了新的方向。通过研究RFVT2的二聚化特性，我们验证了其同源二聚体模型，并发现了病理性变异如何影响其二聚化能力，从而引发内质网应激和线粒体功能障碍。这些机制的阐明有助于开发更有效的治疗方法，以改善RTD2患者的生活质量。