γM23K突变增强了ADP对线粒体F-ATP酶的抑制作用，但对酵母生长速率的影响较小

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：γM23K Mutation Enhances ADP Inhibition of Mitochondrial F-ATPase Yet Has a Minor Effect on Yeast Growth Rate

ADP抑制通过稳定酶构象阻止ATP无效水解，本研究将细菌ATP合酶γM23K突变引入酵母线粒体F1F0-ATP酶ATP3基因，发现突变体显著增强ADP和叠氮化物对ATP酶的抑制作用，但对ρ?细胞（依赖ATP/ADP交换维持质子动势）的生长速率和存活率影响有限，表明该抑制机制在常规代谢中作用有限。

　　这项研究探讨了ADP对ATP水解的抑制作用在酵母线粒体ATP合酶中的影响。ATP合酶是一种在所有F型ATP合酶中广泛存在的调控机制，其功能在于通过ADP与催化位点的紧密结合，使酶进入一种非活跃状态。这种抑制作用被认为能够防止在质子动力势不足的情况下发生的无谓ATP水解。然而，这一机制在细胞生理中的具体作用仍不明确。

研究人员引入了γM23K突变，该突变在细菌ATP合酶中已被证实能够增强ADP对ATP水解的抑制作用。他们通过在酵母线粒体ATP合酶中构建相应的ATP3M23K突变，进一步研究了这一机制在酵母中的表现。在分离的线粒体中，该突变并未影响ATP合成，但显著提高了ATP酶活性对ADP和叠氮化物的敏感性，表明ADP对ATP水解的抑制作用得到了增强。在体内实验中，该突变对可发酵条件下的生长没有影响，仅轻微降低了在不可发酵碳源下生长的rho+细胞的生长速率。令人意外的是，该突变并未影响rho0细胞的生长速率或生存能力，这些细胞依赖于线粒体基质中的ATP水解来维持线粒体膜电位，通过ATP/ADP交换与细胞质进行能量传递。此外，长时间饥饿后未观察到滞后期的显著变化，也未发现静止期培养物中ATP含量的明显差异。这些结果表明，ADP对ATP水解的抑制作用可以在酵母F1-ATPase中选择性增强，而不会干扰ATP合成，同时也提示该调控机制在标准实验室条件下对细胞生理的影响有限。

线状粒体H+转运的F1-ATPase，也被称为复合体V，是一种膜结合的酶复合体，其在细胞生物能学中起着核心作用。这种多亚基的酶复合体由嵌入膜中的F0亚复合体和亲水性的F1亚复合体组成。F0亚复合体负责质子转运，而F1亚复合体则催化ATP的合成或水解。在ATP合成过程中，F0亚复合体中的质子转运由呼吸链产生的质子动力势驱动，导致c亚基的环状寡聚体相对于其他F0亚基发生旋转。这种运动通过γ亚基传递到F1亚复合体，γ亚基在α3β3六聚体内部旋转，从而促进ATP的形成和释放。当质子动力势较低时，酶会反转其活性，成为依赖ATP的质子泵。

在去能化膜中，F1-ATPase能够以较高的速率水解ATP。然而，线粒体ATP合酶的ATP酶活性可以通过至少两种机制被下调，这些机制在ATP/ADP比值下降或质子动力势较低时被激活。其中一种调控机制涉及一种小蛋白IF1（抑制因子1），它结合到酶的亲水性F1亚复合体上，抑制其ATP酶活性。1970年，Asami等人证明了IF1能够抑制ATP依赖的反应，但不影响线粒体中的氧化磷酸化。后续研究（见[8]、[9]）表明，IF1的主要作用是防止在质子动力势下降时发生无谓的ATP水解，这通常由氧气缺乏或呼吸链功能障碍引起。

另一种在所有ATP合酶中普遍观察到的调控机制是ADP对ATP水解的非竞争性抑制。在ATP水解过程中，如果ADP在催化位点结合而没有磷酸的存在，酶可能会进入一种非活跃状态，此时抑制性的ADP被困在位点中。在单分子实验中，ADP抑制状态表现为γ亚基在ATP驱动下的旋转出现长时间的暂停。从ADP抑制状态转变为活跃状态可能由γ亚基的旋转引起，这种旋转可以由热波动或质子动力势驱动，导致抑制性ADP的解离并恢复F1 ATPase的活性。叠氮化物是一种已知的F0F1抑制剂，它能够抑制ATP水解但不影响ATP合成，从而稳定ADP抑制状态。尽管ADP抑制的生理作用被认为与IF1类似，即防止在质子动力势下降时的无谓ATP水解，但直接证据仍然有限。

在面包酵母Saccharomyces cerevisiae中，这些防止去能化线粒体中ATP水解的调控机制对于rho0细胞的代谢至关重要。rho0细胞缺乏线粒体DNA（mtDNA），因此无法通过呼吸或ATP水解维持质子动力势，也无法进行氧化磷酸化。然而，所有F1亚复合体的亚基都由核基因编码，并且在rho0细胞的线粒体基质中可以组装出功能性的F1。这对于rho0细胞至关重要，因为F1的无谓ATP水解会消耗基质中的ATP，并通过腺苷酸载体AAC2促进基质中的ADP3?与细胞质中的ATP4?的电荷交换。这种电荷交换被认为是酵母rho0细胞维持正常线粒体功能（如蛋白质输入、铁代谢等）所必需的质子动力势的唯一来源。类似结论也来自对人类rho0细胞的研究。

研究发现，IF1的过表达会减缓rho0酵母的生长，而IF1基因的缺失则会加速其生长。先前的研究表明，一种减少ADP抑制的线粒体F0F1突变会增加S. cerevisiae细胞在转移到新鲜培养基后的加倍时间和指数生长期前的滞后期。然而，在rho0细胞中，同样的突变反而提高了其生长速率，与表达野生型F0F1的rho0细胞相比。

本研究旨在探讨增强F0F1 ATPase活性的ADP抑制对正常和rho0菌株的酵母生理影响。研究人员选择了γM23K突变，该突变在α-变形菌Rhodobacter capsulatus的F0F1中已被证实能够增强ADP对ATP水解的抑制作用，而不会显著影响ATP合成。γM23残基位于β亚基的负电荷DELSEED序列附近（在酵母酶中为DELSEQD，见图1B），在该位置引入正电荷被认为能够稳定酶的ADP抑制形式。在酵母中，线粒体F0F1 ATP合酶的γ亚基由核基因ATP3编码，因此该突变被命名为ATP3M23K。研究人员假设，如果该突变在酵母线粒体F0F1中同样增强ADP对ATP水解的抑制作用，那么它可能会对rho0细胞的生长产生影响，甚至完全阻止S. cerevisiae在没有mtDNA的情况下生存，使其成为 petite-negative（无法进行氧化磷酸化的细胞）。

在实验中，研究人员对S. cerevisiae的菌株和培养基进行了详细的描述。所使用的菌株基于W303-1A菌株背景，如参考文献[21]所述。rho0菌株是通过将亲本菌株与溴化乙锭共同培养产生的。标准的丰富生长培养基（酵母蛋白胨，YP）如文献[25]所述制备。YP培养基中添加了D-葡萄糖（YPD）、半乳糖（YPGal）或甘油（YPGly）。蛋白胨和酵母提取物从BioSpringer和AngelYeast获得，D-葡萄糖和半乳糖从Helicon获得，甘油则从其他供应商处获取。

研究还分析了ATP3M23K突变对S. cerevisiae线粒体ATP合成和水解的影响。在使用琥珀酸作为呼吸底物的情况下，该突变并未降低线粒体的ATP合成速率。图2A展示了典型的实验轨迹。在两种菌株中，当质子动力势通过解耦剂或F0抑制剂寡霉素耗散时，线粒体的ATP合成完全被抑制。由于线粒体准备可能在ATP合酶含量和其他影响ATP合成速率的因素上存在显著差异，研究人员通过标准化数据来确保实验的准确性。

此外，研究还探讨了ATP3M23K突变对酵母线粒体F0F1活性的影响。γM23K突变（在本研究中称为ATP3M23K）在细菌ATP合酶中已被广泛研究。在大肠杆菌中的研究显示，该突变会破坏ATP水解与质子泵之间的耦合效率。对大肠杆菌F1亚复合体的单分子研究表明，突变的γ亚基在ATP水解过程中仍然能够生成与野生型酶相当的扭矩，但γM23K突变会损害ATP水解过程中的某些关键步骤。

研究人员还总结了他们的发现。结果表明，γM23K突变在酵母线粒体F0F1中增强了ADP对ATP酶活性的抑制作用，这与细菌中的研究结果一致。然而，尽管在分离的线粒体中观察到了明显的效应，该突变对酵母生长和应激反应的生理影响却较为有限。这些发现突显了酵母线粒体能量调控的稳健性，并表明适度增强ADP对ATP水解的抑制作用本身并不足以对细胞生理产生重大影响。

研究人员还列出了他们的贡献。Svyatoslav S. Sokolov负责方法论和实验调查。Olga V. Markova负责方法论、实验调查、正式分析。Dmitry A. Knorre负责撰写、审阅与编辑、撰写初稿、可视化、验证、监督、软件、正式分析、数据整理和概念化。Valeria M. Zubareva负责可视化、验证、方法论、正式分析和数据整理。Kseniia V. Galkina负责撰写、审阅与编辑、验证、方法论、实验调查、正式分析和数据整理。

在写作过程中，研究人员使用了生成式人工智能和AI辅助技术。他们使用了Chat GPT-5来提高英文表达。在使用该工具后，研究人员对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表的文章内容承担全部责任。

这项研究得到了俄罗斯科学基金会（项目编号20-14-00268）和莫斯科国立大学的国家任务（项目编号AAАА-А19-119031390114-5）的支持。研究人员感谢莫斯科大学分子技术与生命系统及合成生物学跨学科科学与教育学校的支持。