离子液体([BMIM][SCN])对hSOD1 R115G突变体中淀粉样蛋白形成的调控

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Modulation of amyloid formation in the hSOD1 R115G mutant by an ionic liquid ([BMIM][SCN])

抑制R115G突变hSOD1蛋白聚集的离子液体[BMIM][SCN]作用机制研究，通过分子动力学模拟和Thioflavin T荧光动力学等实验，证实该离子液体通过稳定中间态、降低局部柔韧性抑制纤维形成，并减少疏水区域暴露，机制涉及抑制早期成核过程。

　　蛋白聚集是导致肌萎缩侧索硬化症（ALS）分子发病机制的关键因素，尤其是在涉及超氧化物歧化酶1（hSOD1）突变体的情况下。随着对ALS病理机制研究的深入，越来越多的注意力集中在开发能够干扰蛋白聚集路径的小分子调节剂上。近年来，离子液体（ILs）因其可调节的物理化学性质，被广泛认为是有效的蛋白聚集调节剂。本研究采用了一种结合计算和实验的方法，评估了1-丁基-3-甲基咪唑??硫氰酸盐（[BMIM][SCN]）对ALS相关R115G突变体引发的淀粉样蛋白形成的影响。通过分子动力学（MD）模拟，我们获得了关于[BMIM][SCN]抑制机制的原子层面的理解，发现该分子主要与R115G突变体中容易聚集的环状区域发生相互作用，从而降低局部的灵活性，并稳定部分折叠的中间态。这些相互作用可能干扰纤维形成过程中至关重要的早期成核过程。此外，在聚集条件下，通过硫黄素T（ThT）荧光动力学实验进一步验证了[BMIM][SCN]的抗淀粉样蛋白作用，结果显示纤维形成显著减少，且具有浓度依赖性。这一趋势还通过透射电子显微镜（TEM）观察得到了确认，显示了纤维结构的明显抑制。进一步地，疏水性探针（ANS）结合实验表明，[BMIM][SCN]减少了疏水区域的暴露，暗示了蛋白质向更紧凑、更不易聚集的构象转变。傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析支持了这些发现，显示出β折叠结构的减少，而β折叠结构是成熟淀粉样蛋白的典型特征。这些结果表明，[BMIM][SCN]能够调节R115G突变体的聚集过程，为理解[BMIM][SCN]如何影响淀粉样蛋白形成提供了机制性的见解。这些发现可能为设计具有治疗潜力的生物相容性离子液体基类化合物提供指导。

神经退行性疾病（NDs）是一类以神经系统在解剖或生理层面逐渐退化为特征的疾病，是老年人群中常见的致病因素，也是认知能力下降的重要原因。在这些疾病中，最常见的是亨廷顿病（HD）、帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。蛋白质由于错误折叠和寡聚化而导致的聚集，会形成细胞内或细胞外的包涵体，这是许多NDs的一个关键特征。聚集蛋白的二级结构决定了其特定的淀粉样蛋白聚集路径。总体而言，淀粉样蛋白聚集的核心机制可以总结为一个三阶段的纤维形成过程：初始的滞后（成核）阶段、随后的延伸阶段以及最后的平台阶段。ALS，也被称为卢·格里奇病，是一种进展性且致命的神经退行性疾病，其特点是上运动神经元和下运动神经元的丧失，导致患者在症状出现后大约三年内死亡。ALS的大多数病例是散发性的（约占90%），只有10%是家族性的。1993年，Rosen等人发现，铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD1）基因的突变是导致ALS遗传形式的原因，这种形式被称为家族性ALS（fALS）。目前，ALS在线数据库（http://alsod.iop.kcl.ac.uk）列出了超过200种与fALS相关的SOD1突变。人类SOD1（hSOD1）是一种同源二聚体蛋白（32 kDa），由两个相同的153个氨基酸单体组成。这种酶包括一个β桶结构，由八个反向平行的β折叠片组成，这些β折叠片由希腊键结构连接，该结构将七个间隔的环状区域连接在一起。每个单体亚基的稳定性由Cys57和Cys146之间的二硫键维持，同时还包括两个铜和锌离子的结合位点。SOD1的二聚界面由多个残基之间的相互作用维持，包括V5、V7、K9、I17、E49-T54、I113-R115和V148-Q153。近年来，许多研究致力于通过计算和实验方法来探讨ALS相关突变如何改变hSOD1的生化和生物物理特性。这些突变可能导致二聚化的丧失、二硫键的破坏、金属离子结合能力的下降、氢键的改变、净负电荷的减少（在某些情况下）以及疏水性的增加。这些结构和功能的变化削弱了蛋白质的稳定性，促进了聚集，从而导致ALS的发病机制。

在1994年，Kostrzewa等人识别出一种与fALS相关的SOD1基因突变。该突变中，精氨酸被甘氨酸取代（R115G），导致正电荷的氨基酸（Arg）转变为中性（Gly）。精氨酸在115位是多个物种中保守的，突显了其功能重要性。鉴于其位于SOD1的二聚界面，精氨酸115的存在对于维持酶的结构完整性至关重要。2010年，Rabe等人对SOD1突变的流行病学进行了研究，并发现R115G是德国fALS患者中最常见的突变。最近对hSOD1中R115G突变的分析表明，该突变会引发结构变化，可能影响酶的稳定性，并促进与ALS相关的有毒聚集物的形成。尽管在ALS的遗传学和病理学研究方面取得了显著进展，但有效治疗的开发仍然进展缓慢。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准的治疗方法包括在1990年代的利鲁唑（riluzole）和2017年的依达拉奉（edaravone）。近年来，一些研究致力于寻找能够抑制ALS相关hSOD1突变体中淀粉样蛋白聚集的新化合物。这些研究已经探讨了多种小分子，包括天然化合物、无机离子和盐类，以识别能够阻止蛋白质聚集的抑制剂。那些能够与蛋白质聚集过程中的不同中间阶段相互作用的小分子引起了广泛关注，因为它们具有作为有效抑制剂的潜力。因此，关注开发一种能够靶向蛋白质聚集过程中的二级成核阶段的分子，可能有助于减少毒性，因为这一阶段会生成最具有毒性的蛋白质种类。在这一背景下，离子液体（ILs）作为传统无机盐的有机类似物，被广泛认为是值得进一步研究的候选物质。离子液体是一类熔融盐，由不对称的有机阳离子与有机或无机阴离子配对组成，通常在100°C或更低的温度下熔融。在不同的离子液体类别中，咪唑??类离子液体，特别是1-丁基-3-甲基咪唑??硫氰酸盐（[BMIM][SCN]），在多个研究中被用于分析其对蛋白质聚集的影响。本研究旨在更好地理解[BMIM][SCN]如何干扰hSOD1的R115G突变体引发的淀粉样纤维形成，并探讨其浓度依赖行为如何影响这一抑制效果。为了实现这一目标，我们采用了一种结合分子对接、分子动力学（MD）模拟以及多种生物物理和生化技术的方法，包括荧光淬灭实验、ANS结合实验、FTIR光谱分析、ThT荧光实验和透射电子显微镜分析。

在建模应用中，我们获得了hSOD1的序列（UniProt ID：P00441）和其野生型晶体结构（PDB代码：2C9V）。2C9V结构被选中，因为它在SOD1结构中具有最高的原子分辨率（1.07 ?）。R115G突变体SOD1使用YASARA进行建模，以野生型hSOD1结构作为模板。随后，对突变体结构进行了几何优化，以最小化立体障碍。为了确保模型的准确性，我们对结构进行了能量最小化和几何优化，以消除不必要的构象变化，并使模型更接近实际的生物结构。在优化过程中，我们特别关注了突变对蛋白质二级结构和三维构象的影响，因为这些变化是导致淀粉样蛋白形成的关键因素。通过分子对接分析，我们进一步确定了[BMIM][SCN]可能的结合位点。采用盲式分子对接方法，我们使用Molegro Virtual Docker对R115G突变体的hSOD1进行了研究，以寻找[BMIM][SCN]的潜在结合位点。结果表明，[BMIM][SCN]主要通过疏水相互作用与突变体中的活性位点区域结合。这种结合方式可能影响蛋白质的折叠路径，从而抑制淀粉样蛋白的形成。通过分子动力学模拟，我们进一步探讨了[BMIM][SCN]与R115G突变体之间的相互作用如何影响其聚集行为。模拟结果表明，[BMIM][SCN]能够与突变体中的某些关键区域发生相互作用，从而改变其动态特性，抑制其进入聚集状态。这些相互作用可能通过稳定部分折叠的中间态，降低蛋白质在聚集过程中的活性，从而减少淀粉样蛋白的形成。

在实验验证方面，我们采用了多种生物物理和生化方法来评估[BMIM][SCN]的抗淀粉样蛋白效果。首先，通过ThT荧光动力学实验，我们观察了[BMIM][SCN]在聚集条件下对淀粉样蛋白形成的影响。实验结果表明，随着[BMIM][SCN]浓度的增加，淀粉样蛋白的形成显著减少，且呈现出浓度依赖性。这一趋势进一步通过透射电子显微镜（TEM）图像得到了验证，显示了在[BMIM][SCN]存在下淀粉样纤维结构的明显抑制。此外，通过ANS结合实验，我们观察到[BMIM][SCN]能够减少蛋白质中疏水区域的暴露，暗示了蛋白质向更紧凑、更不易聚集的构象转变。这些结果表明，[BMIM][SCN]可能通过改变蛋白质的构象和动态特性，抑制其进入聚集状态。同时，FTIR光谱分析也支持了这些发现，显示出β折叠结构的减少，而β折叠结构是成熟淀粉样蛋白的典型特征。通过这些实验方法，我们能够全面评估[BMIM][SCN]对hSOD1 R115G突变体的抑制效果，并进一步探讨其作用机制。

综上所述，本研究通过结合计算和实验方法，揭示了[BMIM][SCN]在抑制ALS相关hSOD1 R115G突变体引发的淀粉样蛋白形成中的重要作用。分子对接和分子动力学模拟表明，[BMIM][SCN]主要与突变体中容易聚集的区域发生相互作用，从而降低局部的灵活性，并稳定部分折叠的中间态。这些相互作用可能干扰纤维形成过程中的早期成核步骤，从而减少淀粉样蛋白的形成。实验方法进一步验证了这些计算结果，显示了在[BMIM][SCN]存在下淀粉样纤维的显著减少。这些发现不仅为理解[BMIM][SCN]如何影响淀粉样蛋白形成提供了机制性的见解，还可能为设计具有治疗潜力的生物相容性离子液体基类化合物提供指导。随着对ALS发病机制研究的不断深入，开发有效的治疗策略仍然是一个重要的挑战。本研究的结果表明，[BMIM][SCN]作为一种潜在的抗淀粉样蛋白剂，可能在未来的ALS治疗中发挥重要作用。