内部替代酶NADH脱氢酶（Ndi1）是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）呼吸链中的电子供体

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics》：The internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) is the electron input in the Saccharomyces cerevisiae respirasome

研究证实酿酒酵母通过Ndi1与复合III?、IV形成的呼吸链超级复合体实现NADH向氧气的电子传递，其动力学机制因复合体形成而改变，且不依赖抗霉素A或氰化物，与尿霉球的复合体不同。该成果首次揭示Ndi1在酵母呼吸链超级复合体中的电子输入作用。

　　在酵母细胞的线粒体结构中，存在一种特殊的呼吸超级复合体，称为呼吸体（respirasome），它在某些情况下能够直接将NADH的电子传递给氧气，从而完成氧化磷酸化过程。尽管大多数生物体依赖于复杂的I（complex I）作为主要的NADH脱氢酶，负责将NADH的电子传递给辅酶Q（ubiquinone），进而通过呼吸链传递至氧气，但酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）却不具备这一结构。相反，酵母中存在三种替代性的NADH脱氢酶：Nde1和Nde2位于线粒体内膜的外侧，而Ndi1则位于内侧。这些酶并不具备质子泵的功能，但它们能够促进NADH向泛醌的电子转移。然而，酵母的呼吸超级复合体中并没有复杂的I，这使得其电子传递机制与大多数真核生物有所不同。

在一项先前的研究中，科学家们发现酵母中存在由Ndi1、complex III?和complex IV组成的呼吸超级复合体，其分子量约为1600 kDa。这一发现引发了对酵母呼吸体功能的进一步探讨。为了更深入地了解呼吸体的结构和功能，研究人员对野生型（WT）和缺失NDE1与NDE2基因的突变株（NDE1Δ/NDE2Δ）的呼吸体进行了分离和活性分析。通过对NADH:DBQ氧化还原酶活性的表征，研究人员发现，呼吸体中的NADH氧化活性显著高于游离的Ndi1。具体而言，WT呼吸体的Vmax值为0.85 ± 0.01 μmol NADH氧化/min/mg，而NDE1Δ/NDE2Δ呼吸体的Vmax值为0.82 ± 0.02 μmol NADH氧化/min/mg，游离Ndi1的Vmax值则为0.51 ± 0.02 μmol NADH氧化/min/mg。这一结果表明，Ndi1在呼吸体中的作用可能与游离状态下的作用不同。

此外，研究人员还发现，呼吸体的电子传递过程对某些抑制剂敏感。例如，当使用黄酮（flavone）、抗霉素A（antimycin A）或氰化物（cyanide）时，呼吸体的氧消耗速率显著下降。然而，这些抑制剂对呼吸体中NADH脱氢酶的活性影响不大，这说明呼吸体中的Ndi1活性并不依赖于其他呼吸复合体的协同作用。这一现象与之前在*Ustilago maydis*中观察到的呼吸体Ndi1活性存在依赖性的结果不同，提示酵母的呼吸体可能具有独特的电子传递机制。

呼吸体的结构和功能在不同生物体中表现出显著的多样性。在哺乳动物心脏线粒体中，呼吸体通常由complex I、III?和IV组成，这种结构有助于维持呼吸链的稳定性和提高电子传递效率。而在酵母中，由于缺乏complex I，呼吸体的组成可能有所不同。尽管酵母的呼吸超级复合体主要由III?和IV构成，但Ndi1的参与使得其在电子传递过程中扮演了重要角色。研究人员通过进一步的实验发现，呼吸体中的Ndi1可能通过与III?和IV的相互作用，改变了其自身的催化机制。例如，游离Ndi1的酶动力学模型遵循随机的Bi-Bi机制，而当其与III?和IV结合后，其动力学模型转变为Ping Pong Bi-Bi机制，这表明Ndi1在呼吸体中的作用方式发生了变化。

这一研究还探讨了呼吸体中Ndi1与其他复合体的相互作用对其功能的影响。Ndi1在呼吸体中的存在可能使其能够直接将电子传递给泛醌，进而参与呼吸链的后续步骤。然而，这种电子传递过程并未表现出直接的底物通道现象，即NADH并不直接通过Ndi1传递给氧气，而是通过泛醌作为中间载体。这与某些其他生物体中的情况不同，例如在*U. maydis*中，呼吸体中的Ndi1活性似乎依赖于与complex III?和IV的紧密联系。相比之下，酵母的呼吸体中Ndi1的活性似乎独立于这些复合体，这可能与其独特的代谢需求有关。

研究还发现，呼吸体中的NADH氧化与氧气的消耗之间存在一定的比例关系。在WT和NDE1Δ/NDE2Δ呼吸体中，NADH/O?比值分别为2.4 ± 1.4和2.4 ± 1.6，这表明呼吸体能够有效地将NADH的电子传递至氧气。然而，这一过程在某些情况下可能受到抑制。例如，当使用黄酮、抗霉素A或氰化物时，呼吸体的氧消耗速率显著降低，这提示这些抑制剂可能作用于呼吸链中的某个关键环节。值得注意的是，这些抑制剂对呼吸体中的NADH脱氢酶活性影响不大，这进一步支持了呼吸体中Ndi1的作用方式可能不同于其他生物体中的情况。

从功能角度来看，呼吸体在酵母细胞中可能承担了类似于其他生物体中complex I的功能。尽管酵母缺乏complex I，但其呼吸体中的Ndi1能够通过与III?和IV的相互作用，完成NADH向氧气的电子传递。这种机制可能有助于维持酵母细胞的能量代谢，尤其是在缺乏复杂I的情况下。此外，呼吸体的结构可能对减少活性氧（ROS）的产生具有重要作用，这与complex I在其他生物体中的功能相似。然而，由于酵母的呼吸体结构不同，其减少ROS产生的机制可能也有所不同。

在实验方法上，研究人员使用了数字甘露醇（digitonin）来溶解线粒体膜，并分离出呼吸体。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）分析，研究人员确认了呼吸体中包含Ndi1、III?和IV。这一结果与之前的报道一致，表明Ndi1在呼吸体中的存在是其功能的关键因素。此外，研究人员还对呼吸体的组成进行了进一步的蛋白质鉴定，以确定其具体结构和功能特征。

这项研究的发现对于理解酵母细胞的呼吸机制具有重要意义。它不仅揭示了Ndi1在呼吸体中的作用方式，还提供了关于酵母呼吸超级复合体结构和功能的新见解。这些结果可能对其他生物体中呼吸体的研究产生影响，尤其是在探讨不同生物体中呼吸链的组织方式和电子传递机制时。此外，这项研究还可能为开发新的抗真菌药物或调控酵母代谢的策略提供理论依据。

总的来说，这项研究通过实验方法对酵母呼吸体的结构和功能进行了深入分析。它不仅验证了呼吸体中Ndi1的存在及其与III?和IV的相互作用，还揭示了呼吸体在电子传递过程中的作用机制。这些发现有助于进一步理解酵母细胞的能量代谢过程，并为其他生物体的呼吸机制研究提供了新的视角。未来的研究可以进一步探讨呼吸体在不同生理条件下的动态变化，以及其在细胞代谢调控中的具体作用。此外，研究还可能揭示呼吸体与其他线粒体功能之间的联系，例如其在细胞凋亡或应激反应中的角色。这些探索将有助于更全面地了解线粒体呼吸链的复杂性和多样性。