利用分段混合dFBA-PLS框架研究介质组成对CHO细胞生长和单克隆抗体（mAb）产生的影响

《Biochemical Engineering Journal》：Investigating the effect of media composition on growth and mAb production in CHO cells using a piecewise hybrid dFBA-PLS framework

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞 fed-batch 培养中，本研究开发了动态通量平衡分析（dFBA）与分段部分最小二乘回归（PLS）结合的混合建模框架。通过24组不同培养基配比的实验，采集了时间分辨的代谢物浓度、细胞量及单克隆抗体（mAb）产量数据。模型验证显示归一化均方根误差（NMSE）<0.15，能精准预测代谢动态并揭示培养基配比对糖酵解、三羧酸循环及氮代谢的影响规律，为数据驱动的培养基优化提供机制性支持。

　　在现代生物制药领域，单克隆抗体（mAb）作为一种重要的治疗性生物制剂，其生产依赖于中国仓鼠卵巢细胞（CHO）的培养过程。CHO细胞因其高表达能力和稳定的遗传特性，成为mAb生产的主要细胞系统。随着生物制药需求的不断增长，mAb市场预计将在2028年达到4450亿美元，占所有生物治疗药物的近一半。因此，如何优化CHO细胞的培养过程，特别是在喂养策略和培养基设计方面，成为提升生产效率和产品质量的关键。

CHO细胞的培养过程涉及复杂的代谢网络，其中糖酵解、三羧酸循环（TCA）和氮代谢等过程对细胞生长和产物生成具有重要影响。传统的培养基优化方法往往依赖于实验经验或高通量筛选技术，但这些方法在面对高维培养基成分时，往往难以高效地找到最优解。因此，近年来，研究者们开始探索结合机制模型与数据驱动模型的混合建模方法，以更准确地预测和优化CHO细胞的代谢行为。

本研究提出了一种新的混合建模框架，将分段偏最小二乘法（PLS）回归与动态通量平衡分析（dFBA）相结合，用于模拟和优化CHO细胞的补料批次培养过程。研究团队通过开展24次Ambr15微生物反应器实验，系统地变化了培养基和接种液的组成。实验过程中收集了时间分辨的代谢物浓度、细胞生物量和mAb浓度，并基于这些数据构建了混合模型。模型在多数代谢物中实现了高预测精度（归一化均方误差（NMSE）小于0.15），并提供了可解释的通量分布图谱。多变量分析揭示了与培养基配方相关的代谢特征，其中特定的培养基组合能够显著改变糖酵解、TCA循环通量以及氮代谢路径。这些发现表明，该模型具备捕捉关键代谢适应性并支持数据驱动的培养基优化能力。

### 1. 问题背景与研究意义

mAb的生产是生物制药领域的重要环节，其应用范围涵盖了治疗、诊断和预防等多个方面。由于mAb具有高度特异性、较长的半衰期、较低的毒性和稳定的药代动力学特性，其市场需求持续增长。然而，CHO细胞的代谢异质性使得培养基优化变得复杂。培养基的优化通常涉及对营养物质的耗竭评估以及喂养策略的调整，以提高细胞生长和产物生成效率。

传统的培养基优化方法包括文献指导的成分选择、经验性的营养物滴定或替换以及现有配方的混合策略。尽管这些方法在一定程度上能够识别营养物与细胞行为之间的关系，但它们在处理高维数据时效率较低，且难以准确捕捉复杂的代谢调控机制。近年来，随着高通量筛选平台和小型微生物反应器系统的普及，实验迭代速度和探索深度得到了显著提升。然而，面对50种以上成分的典型CHO培养基，进行全面的全因子优化仍然是不现实的。

因此，许多工业流程依赖于经过验证的“主培养基”并专注于优化这些基础配方之间的混合比例。这种混合策略被认为是一种实用且可扩展的方法，能够生成和评估多种培养基配方。然而，找到最优的混合比例仍然是一项耗时且具有挑战性的组合任务，因为即使混合比例优化相对简单，其背后涉及的代谢响应依然复杂。

为了应对这一挑战，研究者们开始探索基于机制模型的优化策略。例如，代谢通量分析（MFA）、通量平衡分析（FBA）和动力学建模等方法已被用于揭示营养物消耗、代谢通量分布和副产物生成的机制。这些模型能够提供更严谨的代谢描述，例如通过满足质量平衡，但它们在引入非线性约束时容易出现过拟合问题。因此，将机制模型与经验模型相结合，成为一种可行的解决方案。

本研究提出的混合模型结合了dFBA和分段PLS回归方法，通过将PLS回归模型作为约束条件嵌入dFBA框架中，从而实现了对代谢通量的动态预测。这种方法不仅能够捕捉代谢物浓度和培养基配方之间的非线性关系，还能在不同阶段调整通量约束的灵敏度，从而减少对实验噪声的依赖，同时保持预测的准确性与生物学意义。

### 2. 研究方法与模型构建

研究团队使用Ambr?15自动化微生物反应器系统进行实验，该系统包含24个一次性平行反应器，能够模拟良好的搅拌条件下的细胞培养行为。实验中使用了DG44 CHO细胞，这些细胞能够表达重组单克隆抗体。反应器在14天的补料批次模式下运行，温度、pH值和溶氧水平均被控制在固定设定点（36.8°C、7.1、60% DO）。此外，pH值的维持依赖于CO?的通气和1 M碳酸氢钠的添加。接种密度为3×10?个/mL。

实验中，接种液和补料液分别由五种市售培养基按不同比例混合而成（I0–I4和F0–F4）。每组实验的培养基组成和重复次数详见表1。在实验过程中，每日常规采样并测试残留葡萄糖浓度，补料操作则每天进行一次，每次加入所有补料溶液和葡萄糖。为了维持反应器中的恒定体积，每次补料的量等于采样后去除的体积。

实验数据包括细胞生物量、细胞活力、细胞直径、葡萄糖、乳酸、氨、谷氨酰胺、谷氨酸、丙酮酸等代谢物的浓度。这些数据通过BioProfile FLEX2自动细胞活力分析仪采集，并在6-7分钟内完成分析。剩余样品则离心后储存在-20°C用于进一步分析。同时，Octet QK384与Protein A生物传感器被用于测定最终的IgG滴度。

### 3. 模型开发与验证

模型的开发基于dFBA与PLS回归的结合。具体而言，dFBA被用于模拟时间分辨的代谢行为，而PLS回归则用于建立代谢物浓度与代谢通量之间的关系。这种分段PLS回归模型被设计为与代谢物浓度呈二次关系，而与回归系数呈线性关系，以提高模型的校准能力，同时捕捉非线性代谢行为。

为了评估模型的性能，研究团队将实验数据分为校准集和验证集。校准集用于训练模型，而验证集用于评估模型的预测能力。模型预测的误差被限制在实验噪声范围内，即约10%。这种设置确保了模型在不同喂养和接种策略下的泛化能力。

模型验证结果显示，对于校准集中的代谢物和生物量，混合模型实现了较低的NMSE值。例如，葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸和乳酸的NMSE通常低于0.05，表明模型能够准确重建这些代谢物的动态消耗和生成趋势。生物量的预测误差在0.01至0.03之间，进一步验证了模型的可靠性。此外，氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和丙酮酸也被良好地捕捉，而组氨酸和甲酸则在某些特定组中显示出略高的误差，表明模型在这些代谢物上的表现可能受到实验条件或数据采集的影响。

在验证集中，模型依然表现出较强的泛化能力。葡萄糖、甲酸、甘氨酸和丙酮酸的预测误差保持在较低水平，而生物量的NMSE在0.01至0.03之间。这表明模型能够准确预测在未见条件下的细胞生长和产物生成行为。此外，某些代谢物如谷氨酸和精氨酸在某些组中显示出较高的预测误差，这可能与未建模的氮代谢变化或后期阶段的适应性反应有关。

### 4. 代谢通量分析与路径解读

为了进一步理解代谢物与培养基配方之间的关系，研究团队采用了PLS-DA（偏最小二乘判别分析）方法。PLS-DA能够揭示不同培养基配方对代谢路径的影响，并通过变量重要性在投影（VIP）评分来量化各代谢物对模型的贡献程度。结果显示，13种代谢物（包括葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、氨、乙酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、柠檬酸、甘氨酸、丙酮酸和色氨酸）对生物量增长具有显著贡献。

此外，模型还分析了不同培养基配方对代谢通量的影响。例如，某些组（如组3、8和10）表现出不同的通量模式。组3和组10在糖酵解路径（PGI、PGM、ENO）中表现出较高的通量，而组3还显示出较高的METAT通量，这与甲基化和一碳代谢有关。组10则在ARGSS通量上表现出较高的值，这表明其氮代谢处理更为高效，氨的积累较低。

组8在mAb滴度方面表现最佳，其代谢通量模式显示了较低的TYRTA和TCA循环通量，表明其碳-氮代谢处于平衡状态。而组4和组11则表现出较高的氨通量，这与富含谷氨酰胺的接种液和PLS-DA中谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的负载有关，表明这些组的氮代谢更偏向于分解代谢。

这些通量分析进一步揭示了不同培养基配方对细胞代谢路径的调控作用。例如，一碳代谢路径的通量（如METAT和SAM的生成）与细胞代谢状态密切相关，而氮代谢路径（如ARGSS）则对氨的生成具有重要影响。此外，氨基酸的运输和摄取在培养基优化中也起着关键作用，因为这些代谢物的供给直接影响细胞的代谢活动。

### 5. 模型的优势与未来展望

本研究提出的混合模型结合了dFBA和PLS回归方法，能够有效捕捉CHO细胞在不同培养基配方下的代谢适应性。模型不仅实现了高预测精度，还能够提供可解释的通量分布，从而支持数据驱动的培养基优化。这种模型在工业应用中具有重要价值，因为它能够指导喂养策略的设计，减少对实验的依赖，同时提高培养过程的可控性和可预测性。

此外，该模型还支持未来的研究扩展，例如引入调控层或反馈控制机制。通过在不同阶段调整通量约束的敏感性，模型不仅提高了生物可解释性，还增强了鲁棒性。这种混合建模框架为生物制造过程的预测和优化提供了新的思路。

### 6. 结论

本研究成功实现了基于dFBA与分段PLS回归的混合建模框架，用于模拟和优化CHO细胞在不同培养基和喂养配方下的代谢行为。该模型能够将培养基组成（通过接种液和补料液的分数）与代谢通量分布以及细胞生长和产物生成结果（如生物量和mAb产量）联系起来。实验结果表明，模型在多数代谢物和生物量中实现了高预测精度，验证了其在不同实验条件下的泛化能力。

更重要的是，组别层面的通量分析揭示了代谢行为与培养基配方之间的稳定关联。这些发现表明，细胞代谢不仅受到营养物浓度的影响，还受到培养基配方的特定组合的调控。该框架能够指导喂养策略的设计，识别对有益代谢路径具有最强激活作用的营养物组合，从而支持高效培养基优化。

总体而言，该混合模型为CHO细胞培养提供了可解释、可预测和可扩展的建模工具。通过将培养基成分作为输入变量，模型能够准确预测细胞行为，并为未来的研究提供新的方向。随着多组学数据的整合和自动化培养基设计流程的发展，这种混合建模方法有望在生物制药领域发挥更大的作用。