白介素10基因多态性影响地中海水牛布鲁氏菌病抗性的机制研究

《Heliyon》：The relationship of IL-10 polymorphisms and brucellosis resistance in Mediterranean water buffalo

本研究针对布鲁氏菌(Brucella abortus)利用宿主IL-10免疫调节通路逃逸清除的机制难题，通过整合计算机模拟（分子对接与动力学仿真）与群体遗传学分析，发现IL-10基因g.4002C>T（T175M）多态性可改变蛋白结构、削弱其与受体IL-10R的结合稳定性，从而降低水牛对布鲁氏菌病的易感性（OR=0.45, p=0.015），为家畜抗病育种提供了新策略。

　　

布鲁氏菌病是一种严重危害畜牧业和公共卫生的人畜共患病，由布鲁氏菌（Brucella abortus）引起，可导致水牛等家畜流产、产奶量下降及巨大经济损失。在地中海地区，该病仍呈地方性流行，传统防控手段效果有限。布鲁氏菌作为一种典型的胞内寄生菌，能够巧妙地“劫持”宿主的免疫调节机制以维持其存活。其中，白介素10（Interleukin-10, IL-10）这一关键抗炎细胞因子，成为了双方“博弈”的焦点。正常情况下，IL-10通过抑制过度炎症反应来保护宿主组织，但在布鲁氏菌感染中，病原体反而会刺激宿主产生大量IL-10，从而抑制关键的Th1型免疫应答（特别是干扰素γ (IFN-γ)的产生）和巨噬细胞的杀菌功能，最终有利于细菌在吞噬细胞内建立慢性感染。因此，探索宿主IL-10的遗传变异如何影响其功能，以及这种影响是否与个体对布鲁氏菌病的抵抗力相关，对于开发新的疾病控制策略具有重要意义。

本研究采用了一种创新的组合研究方法：首先利用计算机模拟技术预测IL-10基因单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）对蛋白质结构和功能的影响，随后通过群体层面的关联研究进行验证。研究人员从意大利卡塞塔省的三个水牛群中，根据官方检测方法（缓冲布鲁氏菌抗原试验和补体结合试验）筛选了192头地中海水牛（96头感染，96头未感染）作为研究对象。所有动物在年龄、饲养管理和环境暴露方面具有可比性。关键技术方法包括：对IL-10基因外显子5进行测序以识别SNPs；利用同源建模构建水牛IL-10 (bIL-10) 及其受体 (bIL-10R) 的三维结构模型；通过分子动力学模拟 (Molecular Dynamic Simulations, MDS) 分析SNPs引起的蛋白结构动态变化、氢键网络和稳定性（评估指标包括RMSD、RMSF、RoG）；利用等位基因特异性PCR (AS-PCR) 对筛选出的关键SNP进行大规模基因分型；最后采用统计学方法（如比值比OR和Fisher精确检验）分析基因型与感染状态的关联性。

测序与SNP识别

对30头水牛（15头感染，15头未感染）的IL-10基因外显子5进行测序分析，发现了两个单核苷酸多态性位点：g.3936G>A和g.4002C>T。这两个SNPs分别导致IL-10蛋白质序列发生氨基酸替换：p.Arg153Lys (R153K) 和 p.Thr175Met (T175M)。其中，g.4002C>T (T175M) 多态性被选定为后续深入分析的重点。

同源建模与3D蛋白质结构

为了理解SNPs的功能影响，研究团队通过同源建模构建了水牛IL-10 (bIL-10) 及其受体 (bIL-10R) 的三维结构复合物模型。bIL-10模型以人源IL-10 (PDB: 2ilk.1) 为模板，序列相似度达80.89%，模型质量良好（QMEAN全局得分0.73±0.5，Ramachandran图异常值仅1.11%）。bIL-10R的胞外域模型则以人源IL-10R复合物 (PDB: 1Y6K) 为模板构建，其跨膜区通过Alpha-Fold2进行新预测以模拟膜锚定状态。最终得到的bIL-10/bIL-10R复合物模型经过能量最小化和冲突解决后，通过了MolProbity软件的质量评估。

MDS分析

分子动力学模拟被用来比较野生型(WT) IL-10/IL-10R复合物与包含T175M、R153K以及双突变(KM)的复合物的动态行为。分析结果显示：

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  RMSD（均方根偏差）：所有突变复合物与野生型相比，整体结构偏差不显著。
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  RoG（回转半径）：WT和R153K复合物表现出更好的稳定性，而T175M和KM复合物的紧凑性较差，提示T175M可能影响复合物稳定性。
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  RMSF（均方根涨落）：T175M突变导致bIL-10蛋白中第29至67位以及87至113位氨基酸的灵活性显著降低。尤为重要的是，第42至67位氨基酸构成了与受体结合的关键外部环，其运动受限可能直接影响与bIL-10R的相互作用。
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  氢键分析：在10纳秒的模拟过程中，WT复合物平均形成了19±1.8个氢键，而T175M复合物仅形成15±2.0个氢键，两者之间存在统计学显著差异（p-value = 0.0019）。这表明T175M突变削弱了bIL-10与受体之间的结合强度。

结构与静电分析

为了深入探究结合能力下降的原因，研究人员进一步分析了溶剂可及表面积(Solvent Accessible Surface Area, SASA)和静电势。在9100皮秒的模拟时间点，对WT和T175M复合物的分析发现：

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  静电势变化：T175M突变导致bIL-10R结合口袋区域的正电荷减少（从1.84 kT/e降至1.70 kT/e）。而bIL-10的外部环富含负电荷，受体正电荷的减少直接降低了两者之间的静电吸引力。
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  氢键网络破坏：在WT复合物中，bIL-10的Asp63与bIL-10R的Arg101和Tyr68形成强氢键（距离分别为1.8?和1.6?）。而在T175M复合物中，由于外部环的位移，Asp63与Arg101的氢键完全丢失（距离增至10.2?），与Tyr68的氢键距离也增大至2.6?。总体来看，T175M复合物比WT复合物少了5个氢键。
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  SASA减少：T175M复合物的SASA值（1472.97 ?2）小于WT（1649.44 ?2），表明突变导致复合物界面更疏水，溶剂可及性降低，这也可能影响结合。

关联研究

基于计算机模拟的预测，研究人员对192头水牛进行了g.4002C>T (T175M) SNP的基因分型关联分析。结果证实，携带g.4002T等位基因（导致T175M替换）与对布鲁氏菌病的抗性显著相关（OR = 0.45, 95% CI: 0.24-0.83, p-value = 0.015）。也就是说，在未感染群体中，携带T等位基因（CT或TT基因型）的个体比例显著高于感染群体。

本研究通过计算机模拟与群体遗传学相结合的策略，阐明了IL-10基因上一个特定的非同义突变（T175M）影响地中海水牛对布鲁氏菌病抗性的潜在分子机制。计算机模拟预测表明，T175M替换通过改变bIL-10蛋白关键环区的柔性、减少受体结合界面的正电荷以及削弱氢键网络，从而降低了IL-10与IL-10R的结合亲和力。关联研究则从群体层面验证了这一预测，发现导致该氨基酸替换的g.4002T等位基因是布鲁氏菌病抗性的保护性因子。

其重要意义在于：这种功能减弱的IL-10变体，可能无法被布鲁氏菌有效利用来抑制宿主的保护性Th1免疫反应。如图6所示，正常的IL-10信号通路会抑制MAPK和NF-κB的激活，从而压制促炎细胞因子信号。布鲁氏菌劫持此通路以利于自身存活。而T175M突变可能部分破坏了这一免疫抑制信号，使得宿主的免疫系统（特别是巨噬细胞功能和IFN-γ介导的免疫）能更有效地清除病原体。这为理解宿主与病原体相互作用的遗传基础提供了新的视角。尽管该研究存在一定的局限性，如计算机模拟的预测性质需要后续实验验证，以及样本量可能限制了对特定单倍型（如与TLR4基因多态性组合）效应的统计效力，但其提出的方法学框架——将计算生物学预测与遗传关联分析相整合——为 livestock（家畜）疾病的遗传管理和抗病育种提供了一种富有前景的替代策略。该研究成果发表在《Heliyon》期刊上，为对抗布鲁氏菌病这一持久挑战贡献了新的科学见解。