综述：细胞游离DNA的来龙去脉：生物学与临床意义

《Med》：The comings and goings of cell-free DNA: Biological and clinical implications

本综述由香港中文大学卢煜明教授团队撰写，系统阐述了细胞游离DNA（cfDNA）的生命周期，包括其产生（凋亡、坏死、NETosis等）、清除（核酸酶降解、肾脏过滤、细胞摄取）机制及动力学特征。文章深入探讨了cfDNA在癌症、妊娠、自身免疫病、感染和移植等病理生理状态下的改变，并强调了片段组学（fragmentomics）和表观遗传学特征在液体活检中的巨大应用潜力。文中特别关注了DNASE1L3、DFFB等关键核酸酶的作用，为开发新型cfDNA检测技术提供了重要理论基础。

　　

细胞游离DNA的来龙去脉

自20世纪40年代发现血液中存在细胞游离DNA（cfDNA）以来，这种生物标志物已彻底改变了非侵入性产前检测（NIPT）和肿瘤学等领域。cfDNA如同身体生理和病理状态的“实时信使”，其浓度、大小、末端序列等特征蕴含着丰富的生物学信息。要充分发挥其诊断和预后价值，必须深入理解cfDNA的完整生命周期——从何而来，因何释放，又如何被清除。

cfDNA的产生：多源头的DNA释放

cfDNA主要来源于细胞死亡，包括程序性死亡（如凋亡）和意外死亡（如坏死），以及细胞的主动分泌。

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  凋亡（Apoptosis）：被认为是血浆cfDNA的主要来源。每天约有500-600亿个细胞发生凋亡。其特征是细胞内DNA被 caspase 激活的脱氧核糖核酸酶（CAD/DFFB）等在核小体连接区切割，形成典型的约166 bp的寡核小体梯状条带，这与血浆中cfDNA的主要峰型高度一致。凋亡晚期形成的凋亡小体大部分被吞噬细胞清除（efferocytosis），仅有一小部分DNA会进入循环。
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  坏死（Necrosis）与坏死性凋亡（Necroptosis）：在物理化学应激或某些疾病状态下发生，表现为细胞膜破裂，内容物无序释放，产生高分子量DNA片段（>10,000 bp）并引发炎症反应。
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  焦亡（Pyroptosis）：一种促炎性的程序性细胞死亡，由caspase-1/4/5/11切割gasdermin D（GSDMD）形成膜孔道引发，释放IL-1β、IL-18等炎症因子和高分子量DNA。
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  NETosis：中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的过程，NETs是由去浓缩染色质、组蛋白和颗粒蛋白（如髓过氧化物酶MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶NE）组成的网状结构。NETosis释放的DNA也是高分子量的。
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  主动分泌：活细胞通过细胞外囊泡（EVs），如微囊泡和外泌体，主动将DNA（包括核DNA和线粒体DNA）释放到细胞外。这被认为是细胞维持稳态、清除胞质DNA以避免cGAS-STING通路持续激活的重要机制。
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  造血细胞发育：红细胞生成（erythropoiesis）过程中，正成红细胞脱核形成的pyrenocyte，以及血小板生成（thrombopoiesis）晚期巨核细胞凋亡，都是cfDNA的重要来源。组织溯源分析显示，健康人血浆cfDNA主要来源于造血细胞（如巨核细胞、粒细胞、单核细胞/巨噬细胞）。

cfDNA的清除：快速的周转机制

cfDNA在血浆中的半衰期很短（从几分钟到数小时），这保证了其作为“实时”生物标志物的特性。其清除主要有三条途径：

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  核酸酶降解：血浆中存在核酸酶活性，其中DNASE1L3是降解染色质DNA的关键核酸酶。它由树突状细胞和巨噬细胞分泌，能高效地进行核小体间切割，并偏好产生CC末端的DNA片段。全基因组关联分析（GWAS）发现，DNASE1L3基因是影响cfDNA浓度、片段大小和末端模式的最显著位点。DNASE1则更擅长降解非蛋白结合的裸露DNA，并在尿液中发挥主要作用。
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  肾脏过滤：一部分cfDNA可通过肾小球过滤进入尿液，形成跨肾DNA。由于分子筛效应，只有短的、非组蛋白结合的DNA片段（如<80 bp）才能进入尿液。
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  细胞摄取：肝脏的库普弗细胞（Kupffer cells）和脾脏巨噬细胞等组成的网状内皮系统（RES）是清除cfDNA的主要细胞途径。注射的标记核小体主要被肝脏捕获。细胞表面蛋白聚糖的电荷相互作用、Clec2d等受体对组蛋白的识别，以及血小板的内吞作用，都参与了cfDNA的摄取过程。被内化后的cfDNA在溶酶体中被DNase 2a（DNASE2a）降解。

cfDNA的结构与片段组学

cfDNA在循环中以多种形式存在。核小体结合DNA表现为166 bp的峰和10 bp周期性。长读长测序技术揭示了长cfDNA分子（>500 bp）的存在，它们呈连续的核小体大小单元。此外，还有循环线粒体DNA（mtDNA，无核小体结构，片段较短）、染色体外环状DNA（eccDNA，呈现~202 bp和~338 bp的双峰）以及超短单链DNA（~50 nt，富集于转录起始位点等开放染色质区域）。这些不同的结构和大小特征共同构成了cfDNA的“片段组学”景观，反映了其产生和清除过程中的生物学信息。

不同病理生理状态下的cfDNA

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  癌症：肿瘤细胞通过坏死、坏死性凋亡、凋亡和EVs分泌等多种方式释放循环肿瘤DNA（ctDNA）。肿瘤DNA通常表现出更短的片段分布（90-150 bp富集）和独特的末端模式（如DNASE1L3代表性末端减少）。肿瘤的生长还会导致邻近非肿瘤组织损伤，释放其来源的cfDNA。
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  系统性红斑狼疮（SLE）：其特征是cfDNA清除受损（如DNASE1L3缺乏或活性被自身抗体抑制）和产生增加（NETosis、凋亡等），导致cfDNA积聚，激活免疫系统产生抗dsDNA抗体，参与疾病发生。患者血浆中短cfDNA片段（<115 bp）比例升高，且IgG结合的DNA比例增加。
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  妊娠：母体血浆中的胎儿DNA主要来源于胎盘的凋亡细胞。随着孕周增加，胎儿DNA比例和总cfDNA浓度均上升。胎儿DNA比母体DNA更短，其末端模式也存在差异，可能与胎盘局部高表达的DNASE1L3有关。
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  感染性疾病：血浆中可检测到病原体微生物cfDNA，其片段通常较短（40-100 nt）。宿主cfDNA浓度因组织损伤和炎症（如NETosis、焦亡）而升高，且肝脏清除功能可能受损。
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  移植：移植后早期， donor-derived DNA（dd-cfDNA）水平最高，反映了缺血再灌注损伤。急性排斥反应时，dd-cfDNA fraction会显著升高。通过组织溯源分析，可以监测移植物损伤和全身免疫反应。

展望未来

对cfDNA生物学的深入理解正在推动液体活检技术的革新。例如，通过使用“启动剂”（如脂质体或抗DNA抗体）暂时抑制cfDNA的清除，可以显著提高血浆中ctDNA的浓度，从而可能极大提升早期癌症检测和微小残留病监测的灵敏度。未来，利用类器官模型、CRISPR筛选、蛋白质组学等技术进一步阐明cfDNA释放和清除的细胞类型特异性机制、发现新的核酸酶和摄取受体，以及解析片段组学特征与表观遗传景观的相互作用，将有助于解锁cfDNA在精准医学中的全部潜力，开发出更强大、更个性化的诊断和应用。