TWEAK通过PKM2依赖的NF-κB激活和巨噬细胞M1极化机制加重过敏性结膜炎

《Cellular Signalling》：TWEAK exacerbates allergic conjunctivitis via PKM2-dependent NF-κB activation and macrophage M1 polarization

过敏性结膜炎（AC）病理机制涉及TWEAK通过调控PKM2核转位激活NF-κB信号通路，促进巨噬细胞向促炎M1表型极化。本研究通过体内体外实验证实TWEAK-PKM2-NF-κB轴在AC炎症进展中的关键作用，并揭示PKM2作为该通路核心介导分子的功能。

　　

杨阳|张月志|傅静帆|尹小龙

江西医学院第二附属医院健康管理研究中心，南昌大学，南昌，江西330006，中国

摘要

背景

过敏性结膜炎（AC）是一种常见的眼部炎症性疾病，目前尚无满足治疗需求的有效方法。本研究旨在探讨TWEAK是否调节NF-κB的激活和巨噬细胞的极化，以及其背后的机制。

方法

在体内实验中，建立了卵白蛋白诱导的AC小鼠模型，以评估临床评分、组织病理学和炎症标志物。在体外实验中，将巨噬细胞与结膜细胞共培养，并施加TWEAK调控，以评估PKM2的表达/分布、NF-κB的激活以及巨噬细胞的极化表型。采用共免疫沉淀（co-IP）、Western blot（WB）、实时定量PCR（qRT-PCR）、免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）和流式细胞术（flow cytometry）等方法进行机制研究。

结果

在AC小鼠中，TWEAK敲低减少了PKM2的表达，抑制了NF-κB信号通路，并使巨噬细胞从促炎型M1极化向抗炎型M2极化转变，从而减轻了疾病严重程度。在体外实验中，TWEAK过表达增强了PKM2的核转位，促进了PKM2与NF-κB的结合，激活了NF-κB通路并驱动了巨噬细胞向M1极化。从机制上看，抑制PKM2的核转位可以消除TWEAK诱导的NF-κB激活和M1极化。此外，PKM2过表达逆转了TWEAK敲低在AC小鼠中的抗炎作用，而直接的NF-κB激活则不依赖于TWEAK。

结论

总之，我们的研究发现TWEAK通过PKM2依赖的机制促进NF-κB的激活和巨噬细胞向M1极化，从而加重了AC。本研究确定了TWEAK-PKM2-NF-κB轴是AC发病机制中的关键调节因子。

引言

过敏性结膜炎（AC）是一种常见的眼部过敏性疾病，影响全球15-20%的人口，显著降低了患者的生活质量[1,2]。AC的典型症状包括眼睛瘙痒、发红、流泪和分泌物增多，严重病例可能导致视力受损[3]。目前的临床治疗主要依赖于抗组胺药，如阿卡法替丁和贝他斯汀苯海索酸盐，但由于个体差异和药物副作用，治疗效果在某些患者中仍然有限[[4], [5], [6]]。这一治疗挑战凸显了阐明AC发病机制的新分子机制的紧迫性。

炎症反应在AC发病机制中的作用受到了广泛关注[7]。巨噬细胞的极化涵盖了从促炎型（通常称为M1型）到抗炎型（通常称为M2型）的功能状态，其在调节炎症稳态中起着关键作用[8]。M1型巨噬细胞通过释放促炎细胞因子（如白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）来加剧炎症，而M2型巨噬细胞则通过释放抗炎介质（如白细胞介素-10（IL-10）和白细胞介素-13（IL-13））来促进炎症消退[9]。先前的研究表明巨噬细胞极化参与了过敏性炎症的进展[10]。然而，调控眼部表面促炎型M1型和抗炎型M2型巨噬细胞极化的上游信号机制仍不明确。

丙酮酸激酶（PKM2）的M2亚型是一种关键的糖酵解酶，在肿瘤进展和免疫代谢中发挥重要作用[11,12]。尽管已有研究表明PKM2在肝纤维化和急性肾损伤等炎症性疾病中促进巨噬细胞向M1极化[13,14]，但其在AC期间对巨噬细胞极化的调控作用尚未被探索。此外，PKM2在正常细胞中以酶活性四聚体形式存在，而分离的二聚体则作为转录共激活因子[15,16]。现有证据表明，核内的PKM2作为共激活因子介导了HIF-1α和Nrf2等基因的转录激活[[17], [18], [19]]。核因子κB（NF-κB）是眼部表面炎症的关键调节因子，其激活会加重AC的进展[20,21]。值得注意的是，核内PKM2的持续上调与肿瘤中NF-κB的持续激活相关[22,23]。TWEAK（肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子）及其受体成纤维细胞生长因子诱导因子14（Fn14）属于TNF超家族成员，通过激活NF-κB等信号通路参与炎症和免疫调节[[24], [25], [26]]。我们之前的研究表明TWEAK/Fn14通过抑制Nrf2/HO-1通路破坏Th17/Treg平衡，从而加重AC的进展[27]。Kong等人报告称，TWEAK敲低可降低M1型巨噬细胞水平，减轻炎症和肝纤维化[28]。然而，TWEAK在眼部炎症中调节NF-κB激活和巨噬细胞极化的能力仍不清楚。最重要的是，TWEAK/Fn14信号通路与PKM2之间的功能联系在任何生物系统中都尚未得到证实。

在这里，我们假设TWEAK/Fn14信号通路通过促进PKM2的表达来激活NF-κB，并使巨噬细胞向促炎型M1极化，从而驱动AC的进展。通过整合体内和体外实验方法，本研究首次证明了TWEAK通过调节PKM2表达来影响NF-κB激活和巨噬细胞极化，从而加重了AC的进展。我们的发现不仅揭示了AC发病机制中的新TWEAK-PKM2-NF-κB轴，还为开发新的AC治疗策略提供了潜在的治疗靶点。

实验部分

动物

雄性Balb/c小鼠（8周龄；北京Spiff Biotechnology有限公司提供），在实验前一周在特定无病原体（SPF）条件下进行适应，保持环境参数（温度23-27°C；湿度40-60%；12小时光照/黑暗周期）。所有动物实验均获得南昌大学第二附属医院实验动物伦理委员会的批准。

AC小鼠模型

为了建立AC模型，首先对小鼠进行致敏处理

TWEAK敲低抑制了AC小鼠中PKM2的表达、NF-κB通路的激活以及巨噬细胞向M1极化

通过观察促炎细胞因子（IL-1β、IL-6）随时间增加以及抗炎细胞因子（IL-10、IL-13）相应减少，证实了AC小鼠中炎症状态的逐渐恶化（图1A）。Western blot分析进一步显示，在疾病发展过程中，结膜组织中的TWEAK、PKM2和NF-κB p65蛋白水平逐渐升高（图1B），这表明TWEAK、PKM2和NF-κB p65之间可能存在关联

讨论

本研究发现了一个先前未被认识的TWEAK-PKM2-NF-κB信号通路，该通路在AC的发病机制中起关键作用。我们的研究表明，TWEAK通过其受体Fn14促进PKM2的核转位，增强PKM2与NF-κB的相互作用，激活NF-κB通路，并驱动巨噬细胞向促炎型M1极化，从而加剧眼部表面炎症。

巨噬细胞的极化代表了多种功能状态

结论

本研究确定了TWEAK-PKM2-NF-κB轴是驱动AC发病机制的关键分子通路。我们证明TWEAK促进了PKM2的核转位，激活了NF-κB通路，并驱动巨噬细胞向促炎型M1极化。值得注意的是，TWEAK敲低抑制了NF-κB的激活，恢复了巨噬细胞的稳态，有效减缓了AC的进展。从机制上看，TWEAK通过上调PKM2来增强NF-κB的激活并驱动

资助

无。

伦理批准

所有动物实验均获得南昌大学第二附属医院实验动物伦理委员会的批准。

出版同意

本研究中使用的数据此前未发表过。

作者贡献声明

杨阳：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，研究，数据分析，概念构思。张月志：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据分析，概念构思。傅静帆：撰写 – 审稿与编辑，数据可视化，方法学设计，数据分析。尹小龙：撰写 – 审稿与编辑，实验监督，资源管理，项目协调，概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

不适用。