通过高速原子力显微镜（AFM）揭示了次级转运蛋白中侧向扩散与构象状态之间的动态相互作用

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Dynamic interplay between lateral diffusion and conformational states in a secondary transporter revealed by high-speed AFM

乳糖转运蛋白（LacY）在脂质双层中的横向扩散速度约为3 nm/s，扩散系数约18 nm2/s，表明蛋白在转运前会移动数十纳米。研究显示，底物（乳糖）和离子载体（左旋多巴或新诺霉素）的添加会引发纳米力学和形态变化，揭示电化学梯度、膜力学与蛋白构象状态的紧密关联，说明转运效率不仅依赖静态结构，还受动态移动和膜力学反馈调控。

　　膜蛋白在细胞膜中的结构动态与其周围脂质环境之间的协调关系是理解其功能和开发纳米技术应用的关键。为了深入研究这一现象，我们利用高分辨率的高通量原子力显微镜（HS-AFM）技术，直接观察了重组到膜脂质片中的乳糖渗透酶（LacY）的横向运动和底物诱导的构象变化。LacY 是一种典型的协同转运蛋白，能够将乳糖和一个质子同时运输穿过膜，其运输机制依赖于质子的电化学梯度。通过HS-AFM，我们观察到LacY二聚体以平均速度约3 nm/s进行横向扩散，扩散系数约为18 nm2/s，这表明在每次运输循环前，蛋白质可能移动数十纳米的距离。这种运动不仅影响其运输效率，还可能与膜的机械特性相互作用，进而调控其构象变化。

乳糖和离子载体（如缬氨霉素和尼格里辛）的添加引发了LacY不同的纳米机械和形态学反应，揭示了电化学梯度、膜机械特性和LacY构象状态之间的紧密耦合。这些发现支持了运输效率不仅仅由静态结构决定，而是由蛋白质的横向运动和膜提供的机械反馈动态调控的观点。通过这种动态观察，我们为研究在类似天然环境中的次级转运蛋白提供了机制框架，并突显了HS-AFM在解析复杂膜系统中纳米尺度动态过程方面的潜力。

在膜运输过程中，蛋白质作为介导物质跨膜移动的关键分子，其行为和功能受到多种因素的影响。膜运输蛋白通常分为两类：一类是主动运输蛋白，它们利用化学能或离子梯度驱动物质的跨膜移动；另一类是次级主动运输蛋白，它们通过利用离子的电化学梯度来实现运输。其中，LacY属于次级主动运输蛋白，其运输机制依赖于质子的电化学梯度。LacY的结构由417个氨基酸残基组成，分子量约为45,517 Da，其二级结构包含12个跨膜α-螺旋段，这些段以锯齿状排列穿过膜，连接它们的是11个相对亲水的、位于膜外的周质和细胞质区域。LacY的C端和N端均位于细胞质表面，这使其能够与膜内外的分子相互作用。

LacY的三维结构首次通过构象受限突变体（Cys154→Gly）获得，随后通过调控磷脂成分的结晶过程，成功获得了野生型LacY的结构。这些结构数据为理解LacY的分子机制提供了重要的基础，同时也揭示了其在膜环境中的组织方式。在中性pH条件下，LacY的结构表现为一种稳定的构象，而在酸性条件下，其结构会发生变化，这可能与质子的浓度梯度有关。通过电子显微镜技术，研究者曾成功结晶了LacY与细胞色素b562的嵌合蛋白（LacY/cytb562），并观察到了不同类型的晶体结构。此外，利用原子力显微镜（AFM）技术，研究者在液态介质中获得了准晶体的脂质-渗透酶排列结构，进一步揭示了LacY在膜中的动态行为。

LacY的运输过程不仅依赖于其构象变化，还受到膜内外环境的影响。在膜运输过程中，蛋白质需要在膜表面进行移动，以寻找合适的结合位点和运输通道。这种移动通常被称为横向扩散，它对蛋白质的功能和运输效率具有重要影响。为了研究这种横向扩散，科学家们使用了多种技术，如荧光恢复后光漂白（FRAP）、荧光相关光谱（FCS）和单粒子追踪（SPT）。然而，这些技术主要适用于静态条件下的研究，无法直接观察蛋白质在动态环境中的行为。因此，HS-AFM作为一种能够在接近生理条件下实时观察蛋白质动态的技术，为研究膜蛋白的运动提供了新的可能性。

在本研究中，我们通过HS-AFM技术，观察了LacY在不同条件下的行为。首先，我们制备了由LacY重组在大肠杆菌极性脂质提取物中的膜脂质片（PLSs），并将其铺展在载玻片上。随后，我们在中性pH条件下监测了LacY在存在和不存在乳糖时的行为。为了进一步研究电化学梯度对LacY的影响，我们添加了离子载体（如缬氨霉素和尼格里辛）来改变膜内外的电势差和pH值。这些实验条件使得我们能够观察到LacY在不同刺激下的构象变化和运动行为。

通过HS-AFM的观察，我们发现LacY在膜中的运动不仅受到底物的影响，还与膜的机械特性密切相关。当乳糖被注入系统时，LacY的构象会发生变化，这种变化可能与质子的浓度梯度有关。此外，添加离子载体后，LacY的运动模式也发生了改变，这表明电化学梯度对蛋白质的动态行为具有重要的调控作用。这些结果不仅揭示了LacY在膜中的动态特性，还为理解次级主动运输蛋白的运输机制提供了新的视角。

LacY的运输机制涉及复杂的构象变化和能量转换过程。在运输过程中，LacY通过结合质子和乳糖，利用质子的电化学梯度驱动乳糖的跨膜运输。这种过程需要蛋白质在膜中进行移动，以找到合适的结合位点和运输通道。此外，LacY的运动可能受到膜脂质环境的影响，如脂质的流动性、排列方式和电势差。因此，研究LacY在膜中的动态行为，不仅有助于理解其运输机制，还可能为开发新的纳米技术应用提供理论支持。

在本研究中，我们还发现LacY的运动模式在不同实验条件下具有显著差异。例如，在存在乳糖时，LacY的扩散速度和方向发生了变化，而在添加离子载体后，其运动模式也发生了调整。这些变化可能与膜内外的电势差和pH值有关，同时也可能与LacY自身的构象变化有关。通过HS-AFM的实时观察，我们能够捕捉到这些动态变化，从而揭示LacY在膜中的行为规律。

此外，我们还注意到LacY的运动不仅影响其运输效率，还可能与其调控功能有关。例如，在某些条件下，LacY的运动可能促进其与底物的结合，从而提高运输效率。而在其他条件下，其运动可能受到抑制，导致运输效率下降。这些结果表明，LacY的运输机制是一个动态过程，其效率不仅由静态结构决定，还受到蛋白质运动和膜环境的影响。

总的来说，本研究通过HS-AFM技术，揭示了LacY在膜中的动态行为及其与脂质环境之间的相互作用。这些发现不仅有助于理解次级主动运输蛋白的运输机制，还为研究膜蛋白的动态特性提供了新的方法。通过实时观察蛋白质的运动和构象变化，我们能够更全面地了解其功能和调控机制，从而为生物技术和纳米技术的发展提供理论支持。