《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：A Novel Graphene Oxide–Niclosamide Hybrid as a Potent Antiviral Agent Against Dengue Virus Serotype 3
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石墨烯氧化物-尼洛昔桑复合材料抑制登革病毒3型复制的协同机制研究。通过π-π堆积和氢键作用修饰石墨烯氧化物，显著提升抗病毒活性，在200倍更低浓度下实现75.5%抑制率，其协同效应涉及病毒膜破坏和宿主通路干扰。
潘吉·扎姆扎米·法图罗赫曼（Pandji Zamzami Fathurrohman）|埃科·斯里·库纳蒂（Eko Sri Kunarti）|纳斯蒂蒂·维贾扬蒂（Nastiti Wijayanti）|纳ツホ·萨托（Natsuho Sato）|吉岛良正（Yoshimasa Amano）|町田元夫（Motoi Machida）|斯里·朱阿里·桑托萨（Sri Juari Santosa）
印度尼西亚日惹Sekip Utara地区Gadjah Mada大学数学与自然科学学院化学系，邮编55281
摘要
登革热由登革病毒（DENV）引起，仍然是热带地区的主要全球健康挑战。迄今为止，尚无官方批准的抗病毒药物专门针对DENV感染。基于石墨烯的材料（由碳构成）已显示出对多种病毒的抗病毒潜力。在本研究中，通过将尼洛沙胺（一种具有广谱抗病毒活性的抗寄生虫药物）与氧化石墨烯（GO）结合，制备出了GO-Nic混合材料。GO采用Hummers方法合成，并通过简单混合工艺进行功能化处理。利用RT-qPCR和间接免疫荧光检测方法评估了GO-Nic对DENV 3型（DENV-3）的体外抗病毒活性，同时通过透射电子显微镜（TEM）观察病毒形态及其与GO-Nic的相互作用。结果显示，GO-Nic的抗病毒活性比未经改性的GO提高了60.5%（GO的抑制率为47.2%）。值得注意的是，GO-Nic在低浓度下（仅为未改性GO的1/200）即可发挥抗病毒作用。GO与尼洛沙胺之间的协同效应有助于抑制病毒复制。这些发现凸显了GO-Nic作为新型登革热抗病毒候选物质的潜力。
引言
登革病毒（DENV）仍然是全球主要的健康威胁，2024年全球报告了1410万例病例和9508例死亡病例[1]。作为黄病毒科（Flaviviridae）成员，DENV具有四种抗原不同的血清型（DENV-1至DENV-4），给抗病毒药物的研发带来了重大挑战[2]。尽管影响严重，但目前仍缺乏特异性抗病毒治疗手段，临床管理主要依赖支持性措施[2][3]。由于血清型的多样性以及抗体依赖性增强（ADE）的风险，药物研发进展缓慢。一些策略针对病毒蛋白（如NS5、衣壳蛋白）或宿主因子（如NS4B抑制剂JNJ-1802），但这些方法存在毒性、耐药性或作用范围有限等问题[3][4]。
药物再利用提供了一种更快捷的解决方案。尼洛沙胺是一种长期获批使用的抗寄生虫药物，已证明对登革热、寨卡病毒、SARS-CoV-2等多种病毒具有广谱抗病毒活性[5][6]。其抗病毒机制涉及调节宿主细胞通路，因此具有良好前景。然而，其水溶性差和系统生物利用度低严重限制了其临床应用[7]。
为克服这些限制，可以利用氧化石墨烯（GO）作为纳米载体来增强药物递送效果。GO是一种二维碳基纳米材料，具有高表面积、良好的生物相容性和在水中的优异分散性[8]。GO含有大的π共轭体系，能够通过π–π堆叠与非共价结合方式与尼洛沙胺等芳香化合物相互作用[9]。这种相互作用有助于尼洛沙胺在水中的分散，从而提高其溶解度并可能增加其生物利用度。此外，GO对包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、流感病毒和单纯疱疹病毒在内的多种有包膜病毒具有广谱抗病毒活性[10]。GO的抗病毒机制主要包括破坏病毒膜、抑制病毒附着以及干扰病毒进入宿主细胞[10][11]。GO-Nic混合物结合了两种成分的特性，可能表现出更强的抗病毒效果。
因此，在本研究中，我们制备了GO-Nic混合物（据我们所知，此类混合物此前尚未有相关报道）。随后在Vero细胞中评估了GO-Nic的细胞毒性，以确定最大无毒性剂量，随后利用RT-qPCR方法评估其对DENV-3的抗病毒活性。选择DENV-3作为研究对象是因为该病毒在印度尼西亚的流行程度较高[12]。为进一步了解抗病毒机制，采用了透射电子显微镜（TEM）观察GO-Nic与病毒之间的相互作用。结果表明，GO-Nic即使在低浓度下也能有效抑制DENV-3的复制，可能是通过多种机制实现的。
材料与方法
尼洛沙胺购自Niclosam公司，乙醇（99.5%）购自Cica-Reagents公司。去离子水（DI water）来自Onemed公司，过滤使用Whatman No. 42滤纸。细胞毒性实验所用试剂包括Cell Counting Kit-8（CCK-8；Abbkine）和胎牛血清（FBS；Sigma）。其他试剂包括青霉素-链霉素（pen-strep）、两性霉素B（250 μg/mL）、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和TrypLE酶。
GO-Nic的合成及尼洛沙胺负载能力
尼洛沙胺通过简单搅拌法与GO结合。如图1所示，尼洛沙胺预计通过π–π堆叠和氢键作用附着在GO表面。为确定尼洛沙胺的负载能力，测试了不同的初始浓度。由于尼洛沙胺在水中的溶解度较低[7]，因此使用紫外-可见光谱法对其浓度进行定量。采用标准校准曲线进行结果分析（图2A）。结论
尼洛沙胺成功负载到GO上，其含量根据初始GO-Nic浓度或GO与尼洛沙胺的比例不同而介于2%至25%之间。GO-Nic中尼洛沙胺与GO之间的相互作用包括π–π堆叠和氢键结合。尼洛沙胺的功能化显著增强了其对DENV-3的抗病毒活性，表现出协同效应。在0.2 μg/mL的浓度下，GO-Nic的抑制率为未经改性的GO的75.5%。
作者贡献声明
斯里·朱阿里·桑托萨（Sri Juari Santosa）：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹集、概念构思。埃科·斯里·库纳蒂（Eko Sri Kunarti）：监督、资源调配。潘吉·扎姆扎米·法图罗赫曼（Pandji Zamzami Fathurrohman）：撰写、方法设计、数据分析。町田元夫（Motoi Machida）：撰写、审稿与编辑、监督、资源调配。纳斯蒂蒂·维贾扬蒂（Nastiti Wijayanti）：撰写、审稿与编辑、结果验证、监督、概念构思。吉岛良正（Yoshimasa Amano）：撰写、审稿与编辑、监督。纳ツホ·萨托（Natsuho Sato）：利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究由印度尼西亚共和国研究与高等教育部资助，属于“优秀学生硕士到博士学位教育计划”（PMDSU）（项目编号：2077/UN1/DITLIT/PT.01.03/2024，2024年5月3日）。作者感谢千叶碘资源创新中心（Chiba Iodine Resource Innovation Center，CIRIC）和千叶大学（Chiba University）在XPS测量方面的支持。
