《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design, synthesis, and biological evaluation of novel PROTACs based on unnatural dipeptide CRBN ligands
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本研究开发新型不自然二肽CRBN配体，用于设计靶向BRD4和ALK的PROTAC。结果显示，新型PROTAC具有更强的蛋白降解活性和抗增殖活性，同时减少IMiD相关新底物的降解，避免致畸风险，并具备更好的代谢动力学性质。
Kun Huang|Peng Luo|Cai-Hua Li|Nan Huang|Kun Yao|Xiong-Xiong Lan|Ling-Feng Du|Yan Miao|Qing Tang|Ying Xu|Yong-Xia Zhu|Ning-Yu Wang
中国西南交通大学生命科学与工程学院仿生合成天然药物工程研究中心，成都，610031
摘要
Cereblon (CRBN) 是免疫调节药物（IMiDs）如沙利度胺和来那度胺的作用靶点，作为 CRL4CRBN E3 泛素连接酶复合体的底物识别亚基。这种 E3 连接酶在多种人体组织和器官中广泛表达，并常用于 PROTAC 设计。然而，基于传统 IMiD 的 CRBN 配体的 PROTAC 存在一些局限性，包括由于 CRBN 新底物（如 SALL4）的降解而带来的致畸风险，以及由于 IMiD 架构易水解导致药物代谢和药代动力学（DMPK）特性不佳。因此，开发新型 CRBN 配体对于推进 PROTAC 的发展非常重要。在本研究中，我们设计了针对 BRD4 和 ALK 的新型非天然二肽 CRBN 配体，所制备的 PROTAC 显示出强烈的蛋白质降解和抗增殖活性，其效果与基于 IMiD 的 PROTAC 相当或更优。我们的研究结果表明：(i) 基于二肽 CRBN 配体的 PROTAC 能很好地耐受 N-1 位置的非天然疏水性氨基酸；(ii) 非天然环状亚胺二肽可作为多功能 CRBN 配体，用于设计针对不同靶点的 PROTAC；(iii) 非天然二肽 PROTAC 可减轻 IMiD 相关新底物的降解，但能诱导新型 CRBN 新底物的降解。总体而言，这些非天然二肽 CRBN 配体将扩展 CRBN 招募型 PROTAC 的化学空间和靶点范围，并具有开发针对更多蛋白质的分子粘合剂的潜力。
引言
蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）的概念最初由 Crews 及其同事在 2001 年提出 [1]。PROTAC 利用内源性泛素-蛋白酶体系统通过降解目标蛋白（POI）来实现生物学效应，而不是抑制其功能。PROTAC 通常是一种异双功能分子，由通过连接子与 E3 泛素连接酶配体相连的 POI 配体组成。它诱导 POI 与 E3 连接酶形成三元复合物，导致 POI 被泛素化，随后被 26S 蛋白酶体识别并降解 [2]。与传统的小分子抑制剂相比，PROTAC 在效力、靶点选择性以及克服多种蛋白质的药物耐药性方面具有显著优势 [3]。此外，它们可以将可成药靶点范围扩展到以前“不可成药”的靶点，包括转录因子和细胞骨架蛋白 [3,4]。
招募合适的 E3 泛素连接酶对于高效进行 PROTAC 介导的靶点降解至关重要。尽管人类蛋白质组中存在超过 600 种 E3 连接酶 [5]，但迄今为止在 PROTAC 设计中使用的 E3 连接酶不到 10% [6]。2010 年，Ito 等人确定 cereblon (CRBN) 是免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺及其衍生物来那度胺和泊马度胺的直接靶点 [7]。由于 CRBN 配体（包括 IMiDs 及其类似物）的结构简单且易于衍生，它们在 PROTAC 设计中被广泛采用。基于 CRBN 的 PROTAC 占所有报道的 PROTAC 的一半以上 [8]，并且在目前已公开结构的临床开发 PROTAC 中占比超过 90% [9]（图 1）。尽管它们具有广泛的目标适用性，并且可以轻松优化为低分子量和高降解效力的候选药物，但基于 IMiD 的 PROTAC 仍存在显著的安全性问题及其药物特性的限制。首先，大多数基于 IMiD 的 PROTAC 会显示出脱靶效应，包括降解 IMiDs 的几种新底物（如 SALL4），这导致了与 IMiDs 相关的致畸性 [10]。此外，IMiD 架构（包括邻苯二甲酰亚胺和异吲哚酮）通常稳定性较差，易受水解影响，从而导致药物代谢和药代动力学（DMPK）特性不佳。
最近的研究发现，C-末端环状亚胺是 CRBN 可识别的天然降解基序。含有环状亚胺二肽 CRBN 配体的 PROTAC 可有效降解目标蛋白（如 BRD4），而不会破坏经典 IMiD 的新底物（如 IKZF1/3）[11]。鉴于天然肽在体内易受酶水解的影响，以及二肽 CRBN 配体对 N-1 位置氨基酸的耐受性 [11]，我们推测 C-末端环状亚胺二肽 CRBN 配体的化学空间可以扩展到非天然二肽。基于这些非天然二肽 CRBN 配体的 PROTAC 可以规避基于 IMiD 的 PROTAC 所带来的致畸性，并可能表现出改善的药代动力学特性。在此，我们设计了一系列在 N-1 位置含有非天然氨基酸的新型二肽 CRBN 配体。利用这些二肽配体，我们合成了针对两种经典癌症靶点 BRD4 和间变性淋巴瘤激酶（ALK）的 PROTAC。随后的生物学评估证实了这些分子的蛋白质降解活性和抗肿瘤效果。这些发现支持基于非天然二肽 CRBN 配体的 PROTAC 作为一种多功能策略的发展。
化合物设计
由于 C-末端环状亚胺降解基序主要依赖于 C-末端的环状亚胺结构，且 N-1 氨基残基位于 IMiD 结合口袋的溶剂暴露区域并与 IMiD 的邻苯二甲酰亚胺环重叠 [12]，因此它可以耐受各种 N-1 氨基侧链，特别是非极性和芳香族氨基酸 [11]。我们推测，含有疏水性非天然氨基酸（包括 d-氨基酸）的环状亚胺二肽可以在 N-1 位置发挥作用。
结论
总结来说，本研究描述了新型非天然二肽 CRBN 配体的设计及其在 PROTAC 开发中的应用。通过选择两个已知的抗癌靶点 BRD4 和 ALK，我们发现了具有强蛋白质降解和抗增殖活性的非天然二肽基 PROTAC。这些 PROTAC 显示出与基于 IMiD 的 PROTAC 相类似的蛋白质降解机制，并表现出相当或更好的靶点降解效力。
化学
除非另有说明，所有材料均来自商业供应商，未经进一步纯化即可使用。1H 和 13C NMR 光谱是在Bruker Avance 400 和 600 光谱仪上使用 DMSO-d6 或 CDCl3 作为溶剂在 25°C 下采集的。化学位移（δ）以 ppm 为单位相对于 TMS（内标）报告，耦合常数（J）以赫兹为单位报告，峰多重性分别表示为 s（单峰）、d（双峰）、t（三峰）、q（四峰）、m（多重峰）或 br s（宽峰）。
CRediT 作者贡献声明
Kun Huang：撰写 – 原稿撰写、软件使用、方法学设计、实验研究、数据管理。Peng Luo：撰写 – 原稿撰写、软件使用、方法学设计、实验研究、数据分析。Cai-Hua Li：软件使用、数据管理。Nan Huang：软件使用。Kun Yao：数据管理。Xiong-Xiong Lan：软件使用。Ling-Feng Du：软件使用。Yan Miao：软件使用。Qing Tang：软件使用。Ying Xu：资源获取、实验研究。Yong-Xia Zhu：项目监督、资金筹集。Ning-Yu Wang：撰写 – 审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些因素不会影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢中国自然科学基金（编号：22377100 和 82304454）、四川省自然科学基金（编号：2022NSFSC1338）以及中央高校基本科研业务费（编号：2682023ZTPY011）的财政支持。同时，我们也感谢西南交通大学分析与测试中心提供的 1H NMR 和 13C NMR 测量服务。
