新型异吲哚类HPK1降解剂的设计、合成及药理学评价

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design, synthesis, and pharmacological evaluation of novel isoindoline-based HPK1 degraders

HPK1作为T细胞免疫抑制的关键调控蛋白，其降解剂D02通过PROTAC技术实现高效靶向清除（DC50=3.07±1.81nM），显著抑制SLP-76磷酸化并激活IL-2（EC50=4.51nM）和IFN-γ（EC50=3.02nM）分泌，同时具有HPK1与同源激酶GLK的高选择性。

　　近年来，免疫治疗在抗肿瘤治疗领域取得了革命性的进展，特别是在免疫检查点抑制剂的应用上。这类药物通过调节免疫系统，使机体能够更有效地识别和攻击肿瘤细胞，已在多种恶性肿瘤中展现出显著的临床效果。然而，尽管免疫检查点抑制剂在某些癌症类型中表现优异，但在许多肿瘤亚型中仍存在疗效不足的问题。这一现象提示我们，除了已知的免疫检查点之外，可能还有其他免疫抑制机制尚未被充分理解或利用。因此，探索新的免疫检查点靶点成为克服当前治疗局限的重要方向。

在这一背景下，造血祖细胞激酶1（Hematopoietic progenitor kinase 1, HPK1）因其在T细胞受体（TCR）信号通路中的重要作用而受到关注。HPK1属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MAP4K家族的关键成员，它在T细胞激活过程中通过磷酸化适配蛋白SLP76，促进14-3-3蛋白的募集，从而导致TCR信号复合体的不稳定，进而削弱T细胞的功能。值得注意的是，HPK1缺失的T细胞显示出更强的抗肿瘤浸润淋巴细胞耗竭能力，并对前列腺素E2（PGE2）介导的免疫抑制表现出更高的抵抗性。这些发现表明，HPK1在肿瘤微环境中具有重要的免疫调节作用，其靶向失活可能成为增强T细胞功能、改善抗原呈递并缓解免疫抑制肿瘤微环境的有力策略。

尽管已有大量研究关注HPK1作为免疫治疗靶点的潜力，但目前尚无针对HPK1的小分子药物获得全球监管机构的批准。尽管如此，一些HPK1抑制剂已经进入临床试验阶段，如PF-07265028（NCT05233436，已终止）、BGB-15025（NCT06029127）和NDI-101150（NCT05128487）。此外，还有多种HPK1小分子抑制剂被报道，包括ZYF0033、BAY-405、AZ3264、Cpd5i、Cpd16、Cpd19、GNE-6893和Cpd39。这些抑制剂在单独使用或与免疫检查点抑制剂联合使用时，均显示出一定的临床潜力。然而，其在治疗优化方面仍面临诸多挑战，例如对其他激酶的不充分选择性、免疫刺激效果的不足，以及对HPK1非催化支架功能在肿瘤免疫调节中的理解尚不完整。

最近的研究表明，HPK1的柑橘同源结构域（Citron homology domain, CHD）在调节其免疫调控功能中起着关键作用。然而，传统的ATP竞争性抑制剂难以干扰这一关键的蛋白相互作用区域，这可能影响其在免疫激活方面的最佳效果。因此，开发能够有效靶向HPK1的新型分子工具成为当前研究的热点。

基于这一背景，研究者们开始探索基于蛋白降解技术的新型治疗策略。其中，蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis-targeting chimeras, PROTACs）作为一种新型的双功能小分子药物，为靶向HPK1提供了全新的思路。PROTACs的设计理念是通过连接一种靶向蛋白的配体和一种能够招募E3泛素连接酶的结构，促使靶蛋白被蛋白酶体降解。与传统的抑制剂不同，PROTACs通过一种事件驱动的机制实现靶蛋白的完全降解，而非仅仅抑制其活性。这种机制具有显著的优势，例如能够克服耐药性、消除靶蛋白的催化和非催化功能，从而更全面地干预其在疾病中的作用。

PROTAC技术在HPK1抑制中的应用，为研究其依赖和非依赖的生物学功能提供了强有力的工具。已有多个HPK1降解剂被报道，包括I、II、10m、SS44和DD205–291。其中，SS44是由Liao通过优化HPK1激酶抑制剂ZYF0033的结构而开发的首个报道的HPK1 PROTAC降解剂。SS44在Jurkat细胞中表现出显著的HPK1降解效果（DC50 = 2.84 nM，Dmax = 97%），并且在与PD-1抗体联合使用时显示出增强的抗肿瘤效果。Zeng等人报道的PROTAC I则具有较高的降解活性（DC50 = 1.8 nM）和SLP76磷酸化抑制能力（IC50 = 496.1 nM），但其体内数据尚未公布。Dong等人开发的PROTAC II则具有口服生物利用度高（F = 81.7%）的特点，显示出良好的药代动力学性质。而Zhang等人描述的DD205–291则在体内实验中表现出显著的疗效（TGI = 91.0%），并且在与抗PD1治疗联合使用时效果尤为突出。Tong等人报道的10m则显示出极高的HPK1降解能力（DC50 = 5.0 nM，Dmax ≥ 99%），并且其作用可持续超过72小时。

在此基础上，本研究提出了一种新型的HPK1降解剂D02。D02是基于HPK1抑制剂C16设计和合成的一系列新型HPK1降解剂中的一种。C16作为一种高效的HPK1抑制剂，具有显著的酶活性（IC50 = 0.05 nM），但其在PROTAC设计中的潜力尚未被充分挖掘。因此，研究者们通过系统性地筛选已知的HPK1抑制剂结构，并结合PROTAC技术的优势，设计并合成了多个HPK1降解剂，其中包括D02。D02在Jurkat细胞中表现出优异的HPK1降解能力，其DC50值为3.07 ± 1.81 nM，Dmax值达到98.33%。此外，D02在测试浓度下未观察到对同源激酶GLK的降解作用，显示出对HPK1的高度选择性。

进一步的实验表明，D02不仅能够有效诱导HPK1的蛋白降解，还能够显著抑制SLP76的磷酸化，从而影响TCR信号通路的稳定性。这一结果表明，D02在调控T细胞功能方面具有潜在的治疗价值。此外，D02在人类初级T细胞中能够显著促进IL-2和IFN-γ的分泌，其EC50值分别为4.51 nM和3.02 nM。这些数据表明，D02能够有效激活T细胞的免疫应答，为治疗免疫相关疾病提供了新的可能性。

在初步的毒理学评估中，D02表现出良好的安全性，这为其进一步的临床研究奠定了基础。与现有的HPK1抑制剂相比，D02在选择性和有效性方面均表现出优势。其对GLK的高选择性表明，D02可能能够避免与其他激酶的交叉作用，从而减少潜在的副作用。同时，D02在低纳摩尔浓度下即可实现HPK1的高效降解，显示出其在药物开发中的高潜力。

在蛋白质组学分析中，D02表现出对HPK1的高选择性，这表明其在体内环境中能够精准地靶向HPK1，而不会影响其他相关蛋白的稳定性。这一特性对于药物开发尤为重要，因为它有助于减少药物对非靶点蛋白的干扰，从而提高其治疗特异性。此外，D02在体内实验中的表现也令人鼓舞，其能够有效诱导HPK1的降解，并在与抗PD1治疗联合使用时展现出协同效应。

综上所述，本研究通过系统性地设计和合成一系列基于HPK1抑制剂C16的新型PROTAC降解剂，成功发现了D02这一具有高度选择性和有效性的HPK1降解剂。D02在体外和体内实验中均表现出优异的HPK1降解能力，并能够有效激活T细胞的免疫应答。这些特性使得D02成为一种极具前景的候选药物，有望在未来的癌症免疫治疗中发挥重要作用。此外，D02在初步毒理学评估中表现出良好的安全性，这为其进一步的临床研究提供了支持。未来的研究将着重于D02在不同肿瘤模型中的疗效评估，以及其在临床前和临床阶段的应用潜力。通过进一步优化D02的结构和药代动力学性质，有望开发出一种更安全、更有效的HPK1降解剂，为癌症免疫治疗提供新的解决方案。