针对ABCC6基因的肝脏定向碱基编辑可防止一种假黄瘤弹性纤维化变异人源化小鼠模型中的异位钙化现象

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Liver-directed base editing of ABCC6 prevents ectopic calcification in a variant-humanized mouse model of pseudoxanthoma elasticum

本研究通过肝脏靶向的腺嘌呤基编辑技术纠正PXE患者中最常见的ABCC6 R1164X突变，显著提升血浆PPi水平，并完全预防小鼠皮肤异位钙化，证实肝细胞功能修复可系统性抑制钙化。

　　### 伪性黄色瘤（PXE）的基因治疗新进展

伪性黄色瘤（PXE）是一种遗传性结缔组织疾病，其特征在于弹性纤维在皮肤、视网膜和中型动脉中出现异常钙化。这种疾病是由**ABCC6**基因的致病性变异引起的，该基因编码一种主要定位于肝细胞的跨膜转运蛋白。ABCC6的功能丧失会导致系统性无机焦磷酸盐（PPi）的缺乏，而PPi是一种强力的钙化抑制因子。因此，通过基因编辑技术对肝细胞中的**ABCC6**变异进行修复，并恢复系统性PPi水平，可能为PXE提供一种一次性治疗方案。

在所有PXE患者中，**ABCC6** c.3490C>T（p.R1164X）是最常见的致病性单核苷酸变异之一。本研究旨在评估针对该变异的肝靶向基因修复是否能够有效恢复PPi水平并防止皮肤中的异常钙化。研究中使用了腺嘌呤碱基编辑（ABE）技术，结合一种新型的混合导向RNA（hyb18）来提高编辑效率和特异性。结果显示，通过脂质纳米颗粒（LNPs）递送的ABE8.8 mRNA和hyb18 gRNA，能够在PXE小鼠模型中高效修复R1164X变异，并显著恢复PPi水平和防止异常钙化。

### 研究方法与结果

在本研究中，研究人员首先构建了携带人类R1164X变异的PXE小鼠模型，并通过免疫荧光技术验证了ABCC6蛋白在肝细胞中的表达和定位。结果显示，野生型小鼠的ABCC6蛋白正常定位于肝细胞的细胞膜，而携带R1164X变异的小鼠则表现出显著的蛋白表达减少。随后，研究人员测量了这些小鼠的血浆PPi水平，发现携带R1164X变异的小鼠PPi水平明显低于野生型小鼠，且与**Abcc6**基因敲除小鼠相似，进一步支持了该变异为功能丧失型。

为了评估基因修复对异常钙化的影响，研究人员对携带R1164X变异的小鼠进行了治疗，并在不同时间点（如5周和18周）评估了它们的皮肤钙化情况。结果显示，接受治疗的小鼠在5周时的血浆PPi水平较低，但在18周时已恢复至接近野生型水平。同时，治疗后的携带R1164X变异的小鼠在口腔组织中完全避免了钙化现象，而未接受治疗的小鼠则表现出显著的钙化。此外，研究人员还测试了在饮食中添加高磷和低镁成分是否能够加速钙化过程。结果表明，即使在这样的饮食条件下，接受治疗的小鼠仍然能够有效防止钙化。

### 基因编辑的长期效果

在本研究中，研究人员还评估了腺嘌呤碱基编辑对PXE小鼠的长期效果。通过使用LNPs递送ABE8.8 mRNA和hyb18 gRNA，研究人员在小鼠肝脏中实现了高效的基因修复，并观察到PPi水平的显著恢复。此外，研究还发现，即使在基因修复效率较低的情况下（如15.8%的肝脏修复率），也能有效恢复PPi水平并防止异常钙化。这表明，ABCC6功能的恢复可能只需达到一定的修复阈值即可。

### 代谢假说的验证

研究还验证了代谢假说，即**ABCC6**功能的丧失会导致系统性代谢变化，从而引发结缔组织的异常钙化。研究人员发现，即使在未进行基因修复的情况下，携带R1164X变异的小鼠也会表现出PPi水平的降低，而PPi水平的恢复与钙化现象的抑制密切相关。这一发现支持了代谢假说，并表明通过恢复肝细胞中ABCC6的功能，可以有效逆转系统性钙化。

### 基因编辑的潜在应用

本研究的成果不仅为PXE的治疗提供了新的思路，还可能为其他由**ABCC6**基因变异引起的疾病，如婴儿期全身动脉钙化（GACI）提供治疗方案。由于**ABCC6**基因在肝脏中的表达是系统性PPi生成的关键，因此肝靶向的基因修复可能适用于多种结缔组织钙化相关疾病。

此外，研究还展示了腺嘌呤碱基编辑技术在体内的应用潜力。通过将ABE8.8 mRNA和hyb18 gRNA递送至小鼠体内，研究人员实现了高效的基因修复，并避免了不必要的旁观编辑和脱靶效应。这表明，腺嘌呤碱基编辑技术在治疗遗传性疾病方面具有显著的优势。

### 基因编辑的实现方法

为了实现基因修复，研究人员采用了脂质纳米颗粒（LNPs）作为递送载体，将ABE8.8 mRNA和hyb18 gRNA递送至小鼠肝脏。LNPs的制备过程包括脂质成分的混合、与mRNA和gRNA的结合、离心浓缩、过滤和冷冻保存。这些步骤确保了基因编辑工具的有效递送和稳定保存。此外，研究人员还通过下一代测序（NGS）评估了基因修复的效果，并通过定量分析确定了修复效率和旁观编辑率。

### 未来研究方向

尽管本研究取得了显著进展，但仍有一些问题需要进一步探索。例如，确定基因修复的最低有效阈值、评估基因修复是否能够逆转已经发生的钙化现象，以及探索其他**ABCC6**变异的修复可能性。此外，还需要进行更长时间的跟踪研究，以评估基因修复对PXE患者长期生活质量的影响。

本研究为PXE患者提供了一种潜在的治疗方案，即通过基因编辑技术修复**ABCC6**基因变异，从而恢复PPi水平并防止异常钙化。这一方法不仅具有较高的治疗效率，而且避免了传统基因编辑技术可能带来的脱靶效应和细胞毒性。未来，随着基因编辑技术的不断进步，这种方法可能成为治疗PXE及其他相关疾病的首选方案。