利用纳米流式细胞术对哺乳动物细胞外囊泡进行系统性表征

《Extracellular Vesicle》：Systematic characterization of mammalian extracellular vesicles using nano-flow cytometry

外泌体（EVs）的异质性及标准化表征方法研究。采用纳米流式细胞术（nFCM）对比血清补充与血清-free培养基条件，发现血清-free培养基可显著减少外源颗粒污染（减少56倍），但需平衡细胞活力（HEK293T存活率＞80%）。分离方法中，超速离心纯度达73-81%，但EV浓度（1.8-3.6×10?/mL）低于超滤法，后者因截留分子量差异（100kDa膜）导致更高的脂质+颗粒浓度。细胞类型影响显著：胶质瘤细胞（U-87 MG）分泌EV中CD9占比55.1%，而间充质干细胞（hMSC）CD9仅8.3%，CD63/CD81分别占21.2%/20.8%。研究证实需结合单颗粒分析技术解决传统方法（如Western blot）无法捕捉的异质性，建立跨研究的标准化EV表征框架。

　　外泌体（Extracellular Vesicles, EVs）是细胞分泌的纳米级膜包裹颗粒，能够运输具有生物活性的物质，并在细胞间通讯中发挥重要作用。近年来，EVs因其在疾病诊断和治疗中的潜力而受到广泛关注。例如，它们可用于非侵入性检测和监测如胶质母细胞瘤等复杂疾病，还可以作为药物或核酸的载体，应用于细胞外治疗。然而，EVs的研究和应用仍面临诸多挑战，尤其是在EV的分离和纯化方面。由于EVs的异质性，以及培养基中可能存在的外源性颗粒污染，传统的分离方法往往难以获得高质量、均一的EV样本。

在EV的分离过程中，常用的包括超速离心、超滤、聚合物沉淀、尺寸排阻色谱、免疫磁性提取、密度梯度超速离心和切向流过滤等方法。这些方法在不同程度上能够提高EV的纯度和产量，但它们通常依赖于非特异性的物理特性，如尺寸或密度，来区分EV与其他颗粒。这种方法的一个局限性是，无法准确识别EV的分子异质性，特别是在单个颗粒层面。因此，研究者开始探索更精确的分析方法，以更好地理解EV的组成和功能。

纳米流式细胞术（Nano-flow Cytometry, nFCM）作为一种新兴的高分辨率技术，提供了对EV进行单颗粒表型分析的手段。通过nFCM，可以同时测量EV的尺寸、浓度以及表面标记物的表达情况。这种方法能够克服传统技术在检测小型EV和区分不同标记物方面的不足，为EV的全面分析提供了新的可能性。研究团队在本研究中利用nFCM对从HEK293T、U-87 MG和人源间充质干细胞（hMSCs）等细胞培养中获得的EV进行了分析，揭示了不同细胞类型在EV产量和标记物表达方面的差异。

研究还发现，传统培养基中的胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）会引入大量外源性EV，这会降低最终EV的纯度。因此，采用无血清培养基成为一种减少污染的有效策略。然而，无血清条件可能会影响细胞的生长和存活，从而改变EV的产量和组成。为了解决这一问题，研究团队评估了不同时间点下HEK293T细胞在无血清培养基中的存活率，并发现细胞在无血清条件下可以维持较高的存活率，特别是在15小时内。这一发现支持了在短时间无血清培养下进行EV收集的可行性。

此外，研究还对比了两种常用的EV分离方法——超速离心和超滤。通过nFCM分析，发现超速离心能够获得更高的EV纯度和产量，而超滤则在浓度上表现更优。尽管两种方法在EV的产量和纯度上存在差异，但它们在特定标记物的表达比例上表现相似，表明这些方法并不能选择性地富集特定的EV亚群。这进一步强调了EV异质性在研究中的重要性，以及在不同实验条件下，选择合适的分离方法和分析工具的重要性。

研究还展示了不同细胞类型在EV标记物表达上的差异。例如，来自U-87 MG胶质母细胞瘤细胞的EV显示出较高的CD9和CD81表达，而来自hMSC的EV则表现出更高的CD63和CD81表达。这些结果不仅揭示了EV在不同细胞来源中的异质性，也为EV在诊断和治疗中的应用提供了基础。例如，某些标记物可能在特定细胞类型中更为显著，这可能影响其在疾病诊断中的适用性。

为了进一步验证这些发现，研究团队使用了冷冻电镜（Cryo-EM）对EV的形态进行了观察，确认了EV的膜结构。这一发现支持了EV作为生物标记物和治疗载体的潜力。同时，研究还探讨了EV的纯度评估方法，通过Triton X-100处理，可以区分完整的EV与非EV的杂质。结果表明，超速离心处理的EV纯度更高，而超滤则可能引入更多杂质。

本研究的结果强调了在EV研究中，选择合适的培养基和分离方法对于获得高质量的EV样本至关重要。此外，使用nFCM等高分辨率技术能够更全面地评估EV的异质性，从而为EV的功能和应用研究提供更可靠的数据支持。通过这些分析，研究团队不仅揭示了EV在不同细胞来源中的差异，还为未来的研究提供了标准化的评估框架，有助于提高研究的可重复性和可靠性。