秸秆还田通过改变土壤中氮的代谢分布和循环过程，有助于提高土壤中氮的可用性

《Farming System》：Straw return facilitates the availability of soil nitrogen by altering the metabolic distribution and nitrogen cycling processes

秸秆还田显著促进土壤氮循环，通过改变微生物群落结构及代谢途径增强氮固定与反硝化作用，抑制硝化过程，提高无机氮和有机氮含量。研究采用多年度定位试验，分析连续玉米种植与休闲耕作下土壤氮动态、微生物组成及功能基因表达，揭示秸秆还田通过调控微生物群落和代谢网络提升土壤氮可利用性。

　　秸秆还田（SR）作为一种可持续的农业实践，被广泛应用于提升土壤有机碳（SOC）含量和土壤肥力。然而，关于其对土壤氮（N）动态、微生物群落、代谢过程及其潜在机制的影响，仍存在诸多未知领域。本文通过多年对连续玉米种植（CC）和休耕（FR）系统中秸秆还田的操控实验，揭示了SR如何通过改变土壤微生物代谢来促进氮的可利用性。此外，SR还通过增强代谢途径，如精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，以及嘧啶和嘌呤代谢，推动了氮的转化过程。同时，SR显著提高了参与矿化和固氮的微生物及功能基因的丰度，如*glmA*和*ureC*，以及固氮菌如*Bradyrhizobium*和*Altererythrobacter*。然而，尽管SR降低了硝化微生物和功能基因（如*Nitrososphaera*、*Nitrospira*、*Sphingomonas*、*amoAB*和*nxrA*）的相对丰度，但其增强了土壤中可提取的无机氮和有机氮的含量。因此，SR被认为是一种有效策略，能够促进氮的动态变化并加速土壤肥力的恢复。

在农业生态系统中，氮循环是土壤生物地球化学过程的关键组成部分，涵盖了外源氮输入、内部转化和相关损失。秸秆的分解是由一系列微生物生命活动驱动的，这些活动在调节土壤氮动态中起着核心作用。因此，深入理解氮代谢途径对于优化生物可利用氮库和推动可持续农业发展至关重要。已有研究表明，秸秆还田通过调控转化途径来增加土壤氮库，同时减少氮损失，从而带来显著的环境效益。例如，一些研究指出，秸秆还田可以提高固氮细菌的多样性和丰度，以及与氨氧化和反硝化相关的功能基因的表达。此外，秸秆还田还影响了反硝化脱氮（DNRA）过程，调节了其活性和相关功能基因的丰度。尽管这些发现强调了秸秆还田在塑造土壤微生物群落及其对氮循环的功能贡献中的重要性，但目前尚缺乏将所有相关过程整合到统一框架中的研究。

土壤代谢物，如碳水化合物、脂质、有机酸（OA）和氨基酸（AA），是土壤生物地球化学循环的基本组成部分，主要由微生物活动驱动。碳水化合物和有机酸通常在根际区域占据主导地位，并参与关键的生化过程。碳水化合物及其衍生物通过有氧和无氧分解生成能量，产生合成AA、丙酮酸、脂肪酸和核酸所需的中间产物。有机酸影响了主要土壤微生物群落的组成和结构。作为土壤微生物和植物争夺的关键有机氮来源，AA不仅作为信号分子，还作为调节因子，促进某些微生物类群的生长，同时抑制其他类群。土壤微生物对植物残留物中有机氮的吸收受到碳和氮的可用性和平衡的影响。与碳水化合物不同，AA能够同时满足土壤微生物的碳和氮需求。当单独作为代谢底物时，AA和碳水化合物会引导土壤微生物通过两种不同的途径利用氮：直接途径，即直接吸收小分子有机氮化合物；以及微生物矿化-固持-周转（MIT）途径，其中有机氮首先矿化为NH??–N，然后再被微生物吸收。然而，目前关于微生物群落变化所介导的生物过程如何调节土壤代谢物动态并促进土壤质量改善的研究仍较为有限。

本研究旨在通过分析土壤代谢物与微生物群落结构之间的相互关系，阐明秸秆还田土壤中氮循环的生物过程。基于连续玉米种植（CC）和休耕（FR）处理下的长期田间实验，我们评估了秸秆还田对微生物功能特征、代谢途径及其对土壤氮库贡献的影响。我们假设：（1）秸秆还田通过主要增加微生物代谢产生的氨基酸氮（AAN）积累，从而扩大土壤有机氮库；（2）通过调节微生物代谢产生的AA和碳水化合物的可用性，改变微生物氮吸收途径；（3）通过改变氮代谢途径来提高土壤氮的可利用性。

实验地点位于中国黑龙江省哈尔滨市东北农业大学校园研究站，从2016年至2021年进行。实验采用柱状连续定位方法，将底部无孔的种植柱嵌入土壤中，并保持与周围土壤水分和养分的连通性。种植柱由硬化塑料制成（直径30 cm × 高度33 cm），填充30 cm深的土壤，延伸3 cm至地面以上，每个柱子的土壤质量约为26 kg。土壤取自2015年玉米田的耕作层，其基线养分含量包括37.11 g kg?1有机质（OM）、1.46 g kg?1总氮（TN）、0.65 g kg?1总磷（P）、15.8 g kg?1总钾（K）、48.20 mg kg?1硝酸盐氮（NO??–N）、16.9 mg kg?1铵态氮（NH??–N）、50.44 mg kg?1有效磷和170 mg kg?1有效钾。实验包括两种秸秆处理：无秸秆还田（NS）和秸秆还田（SR），在连续玉米种植（CC）和休耕（FR）系统中各设六个重复。每年4月15日至20日，将粉碎的玉米秸秆以每柱260 g（相当于每公顷36.80 t）的速率加入0-15 cm的土壤层。自2016年起，每年在柱子中进行玉米继代试验，基于前一年的秸秆还田处理。每柱播种六粒玉米种子，覆盖2-3 cm的土壤，并在出苗后保留一株植物。在播种前，施加肥料，包括尿素（46% N，350 kg ha?1）、重过磷酸钙（44% P?O?，150 kg ha?1）和硫酸钾（50% K?O，150 kg ha?1），其中一半的尿素作为基肥施用，其余一半在拔节期施用。休耕处理不施用肥料。

土壤采样于2021年10月15日进行，使用经过75%乙醇灭菌的土壤钻头在0-15 cm深度采集。采样后去除可见的碎根和石头，将样品分为两个子样，一个储存于-20°C用于氮分析，另一个储存于-80°C用于DNA和代谢物提取。

土壤总氮（TN）采用浓硫酸消化-凯氏定氮法测定。硝酸盐氮（NO??–N）和铵态氮（NH??–N）的测定参考了Lu（2000）的方法，略有调整。简而言之，取5 g新鲜土壤，用2 mol L?1 KCl溶液提取30分钟，分析上清液使用连续流动分析仪（SAN++，Skalar，荷兰）。可利用氮（AN）计算为硝酸盐氮和铵态氮浓度之和。土壤有机氮组分的定量按照Bremner（1965a）的方法进行。简而言之，使用封闭管酸水解法制备土壤酸解液，总酸解氮（TAHN）通过凯氏定氮法测定，酸解铵氮（AMN）通过添加3.5% MgO悬浮液进行蒸馏测定，酸解氨基酸氮（AAN）则通过磷酸硼缓冲液蒸馏法测定。相同的缓冲液蒸馏方法也用于测定AMN与酸解氨基酸糖氮（ASN）的总和，而酸水解未知氮（HUN）和非酸水解氮（AIN）则通过差值计算。具体而言：HUN = TAHN - AMN - AAN - ASN；AIN = TN - TAHN。

氮氧化亚氮（N?O）排放潜力采用静态室法，参考Qiu等（2019）的方法略有调整。取20 g干土加入100 mL棕色玻璃瓶中，加水使土壤含水量达到水孔隙空间的60-70%。经过三天预培养后，将瓶口用橡胶塞密封，在25°C无氧条件下培养10小时。气体样品使用10 mL聚乙烯注射器收集，并转移至10 mL真空密封玻璃瓶中。所有样品在24小时内通过气相色谱分析。

土壤硝化潜力的测定参考Regan等（2017）的方法，略有调整。取2 g干土样本，加入10 mL 10 mmol L?1 (NH?)?SO?溶液，随后加入500 μL 0.15 mol L?1 KClO?溶液以抑制NO??–N向NO??–N的氧化。混合物在25°C下摇晃培养5小时后，加入2.5 mL 2 mol L?1 KCl终止反应，并继续培养20分钟。培养结束后，样品在2000 × g下离心2分钟，取150 μL上清液转移至96孔微孔板中，加入90 μL NH?Cl缓冲液和60 μL含2 mmol L?1 C??H??N?·2HCl、0.06 mol L?1 C?H?N?O?S和2.5 mol L?1磷酸的硝酸盐试剂。在540 nm波长下使用微孔板读数仪测定吸光度。硝化潜力以每克干土每小时产生的NO??–N量（μg g?1 h?1）表示。

新鲜土壤（约0.5 g）用于土壤DNA提取，使用Tengen磁珠试剂盒。提取的DNA纯度和完整性通过评估进行确认。随后使用NEBNext? Ultra DNA文库制备试剂盒构建文库。确认插入片段大小符合预期标准后，使用定量PCR（qPCR）测定有效文库浓度。文库浓度大于3 nmol L?1的样本用于Illumina PE150测序。最后分析微生物群落组成和功能潜力。详细方法见补充材料1。

约100 mg样品称重后，使用500 μL 80%甲醇水溶液提取，涡旋、摇晃并在冰上孵育5分钟。混合物在4°C下以15,000 × g离心20分钟（Scilogex D3024R，美国）。上清液用LC-MS级水稀释至最终甲醇浓度为53%，再进行第二次离心。所得上清液通过LC-MS/MS分析，方法参考Want等（2013）。LC-MS/MS数据文件使用Compound Discoverer 3.1（Thermo Fisher Scientific）处理，并与KEGG数据库进行代谢物注释。详细方法见补充材料1。

土壤氮含量、功能基因丰度、微生物相对丰度和代谢物丰度在不同处理间的差异通过独立样本t检验在SPSS 26.0中进行评估。在t检验分析前，对数据进行正态性和方差齐性检验。数据可视化使用SigmaPlot 14.0和R版本4.4.2进行。

在代谢组学分析中，使用“ropls”包对1,510个检测到的代谢物进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以获得每个代谢物在第一主成分上的变量重要性投影（VIP）得分。组间p值通过学生t检验计算，而倍数变化（FC）用于评估差异丰度。VIP > 1.0、FC > 1.5且p < 0.05的代谢物被鉴定为差异代谢物（DMs），并通过“ggplot2”包进行可视化。DMs的百分比分布使用“treemapify”包进行可视化，热图使用“pheatmap”包生成。

在宏基因组分析中，基于门级注释将微生物分类为细菌、真菌和古菌。使用“vegan”包进行主坐标分析（PCoA）和相似性分析（ANOSIM）。筛选KEGG注释的氮循环相关功能基因，并根据Sieradzki等（2023）的方法构建代谢网络。氮循环相关微生物基于Yang等（2019）、Kim等（2021）和Duan等（2023）的研究结果进行鉴定，并使用“pheatmap”包和SigmaPlot 14.0进行可视化。

相关网络分析使用R中的“ggraph”和“igraph”包进行，而Gephi软件用于网络渲染和节点提取。在相关网络分析中，使用“psych”包进行相关性分析。处理缺失值使用“pairwise”方法，计算相关系数使用“spearman”方法，并使用“fdr”方法进行多重检验校正，显著性阈值设定为0.05。使用“circlize”包生成弦图，使用“plspm”包进行偏最小二乘路径建模（PLSPM）分析。实线箭头表示正相关，虚线箭头表示负相关，箭头厚度表示绝对值路径系数的大小，箭头旁的数字表示路径系数，星号表示相关性达到显著水平（*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001）。R2值表示模型对因变量变异性的解释比例，拟合度值表示模型的拟合程度。

研究结果表明，SR显著增加了土壤氮含量，并改变了土壤有机氮组分的组成（图1）。与NS相比，SR显著提高了CC和FR处理下NH??–N、NO??–N、AN、AAN、AMN、HUN和ASN的含量，但显著降低了土壤硝化潜力，对N?O排放无明显影响（图1）。此外，SR显著增加了参与氮循环的微生物类群的总丰度，包括固氮菌、反硝化菌、硝酸盐还原菌（DNRA）和氮矿化菌（N mineralization）。然而，与NS相比，SR显著降低了硝化菌（如*Nitrospira*）和氨氧化古菌（如*Nitrososphaera*、*Candidatus Nitrosocosmicus*、*Candidatus Nitrosotalea*、*Nitrosopumilus*和*Candidatus Nitrosopelagicus*）的相对丰度。这些微生物在SR处理下显著减少，而SR处理下则显著增加了*Bacteroides*和*Rhodopirellula*的相对丰度，表明其在氮循环中的重要作用。

在土壤代谢物池中，AA被视为有机酸（OA）的一个亚类，而碳水化合物则被归类为有机氧化合物（OO）。AA和碳水化合物的相对丰度可能影响土壤微生物利用的氮代谢途径。差异代谢物分析显示，AA及其类似物的多样性和丰度显著高于碳水化合物（图S3和图S4）。这表明，在秸秆还田后，大量氮可能通过直接吸收途径被微生物直接利用。此外，AA的丰富度可能促进微生物通过直接吸收AA和氨的同化来固定氮，从而推动能量生成过程，如微生物增殖和三羧酸循环（TCA cycle）。过量的氮通过嘌呤、嘧啶和AA代谢释放为NH?，从而促进微生物MIT途径。同时，SR通过刺激DNRA、ANRA和固氮过程，显著提高了土壤中NH??–N的保留量，同时抑制了硝化作用（图7）。在固氮过程中，SR显著提高了*Bradyrhizobium*和*nifH*的相对丰度，表明其在氮固定中的重要作用。此外，在FR处理下，SR显著提高了固氮相关基因的丰度，表明其在促进氮循环中的关键作用。

相关网络共现分析和PLSPM分析表明，土壤有机和无机氮含量的增加是由SR直接和间接调控的。SR通过增加Copiotrophic类群（如Proteobacteria）的丰度，改变了微生物β多样性，同时减少了Oligotrophic类群（如Chloroflexi和Nitrospirae）的丰度。微生物群落的改变导致了与固氮、矿化、DNRA和ANRA相关的功能基因丰度增加，而与硝化相关的基因丰度减少，同时促进了关键代谢物如有机酸的积累。因此，秸秆分解、氮循环基因的功能变化以及有机酸等代谢物的整合共同推动了氮循环过程的转变，最终提高了土壤氮含量（图6）。

综上所述，本研究的结果表明，秸秆还田通过丰富分解微生物，如Proteobacteria、Bacteroidetes和Ascomycota，促进了秸秆的分解，并在连续玉米种植和休耕处理中增加了有机酸、氨基酸和碳水化合物的积累，从而为微生物代谢活动提供了能量。AA的显著富集有利于土壤微生物通过直接氮吸收途径优先利用氮。微生物通过直接吸收AA和氨的同化固定氮，促进了能量生成过程，如微生物增殖和TCA循环。过量的氮通过嘌呤、嘧啶和AA代谢释放为NH?，从而促进了微生物MIT途径。此外，SR通过刺激DNRA、ANRA和固氮过程，显著提高了土壤中NH??–N的保留量，同时抑制了硝化作用（图7）。固氮过程中，SR显著提高了*Bradyrhizobium*和*nifH*的相对丰度，表明其在氮固定中的重要作用。在FR处理下，SR显著提高了固氮相关基因的丰度，表明其在促进氮循环中的关键作用。

相关网络共现分析和PLSPM分析进一步揭示了SR如何通过改变微生物β多样性，增加与固氮、矿化、DNRA和ANRA相关的功能基因丰度，同时减少与硝化相关的基因丰度，从而调控土壤氮含量。SR不仅增加了关键代谢物如有机酸的丰度，还通过改变微生物群落结构，促进了氮循环过程的转变，最终提高了土壤氮含量（图6）。这些发现表明，秸秆还田在农业土壤中对氮循环的调控作用主要通过微生物群落的结构和功能变化实现。此外，SR在不同处理下的应用效果存在差异，特别是在休耕处理下，其对微生物群落的影响更为显著，表明在不同农业实践下，秸秆还田对氮循环的促进作用可能有所不同。未来的研究需要进一步探讨不同农业系统下秸秆还田对氮循环的具体影响机制，并结合更先进的分析技术进行验证。