《Fish & Shellfish Immunology》：DHA affects ISKNV-induced autophagy flux via the AMPK/mTOR/ULK1 and BECN1/SQSTM1 axes, limiting viral replication in fish cells
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DHA通过调控AMPK/mTOR/ULK1和BECN1/p62/SQSTM1信号通路抑制ISKNV诱导的自噬流，显著提高宿主细胞存活率并降低病毒滴度。
Kuang-Wen Chen|Chien-Fu Huang|Jen-Leih Wu|Jiann-Ruey Hong
分子病毒学与生物技术实验室，生物技术与生物工业科学系，生物技术研究所，国立成功大学，台湾省台南市大学路1号，701
摘要
二十二碳六烯酸（DHA）在生物体内扮演着重要角色，包括参与细胞膜的结构和流动性、抗氧化以及抗炎作用。关于DHA对自噬通量调节的影响的研究非常少，尤其是在大型DNA病毒方面。在本文中，我们证明了ISKNV可以通过AMPK/mTOR/ULK1和Beclin-1（BECN1）/p62（SQSTM1）通路触发宿主细胞的自噬过程，而这些通路在GF-1细胞中会被DHA抑制。我们发现，在感染后第5天，10 μM的DHA处理可以将宿主细胞的存活率提高至85%。随后，在自噬体检测中，我们观察到在ISKNV感染GF-1细胞后，DHA处理组的MDC阳性信号减少了50%。在自噬标志物LC3-II方面，我们发现ISKNV可以诱导自噬相关标记物的产生，但这种效应在感染后第3天和第5天也被DHA处理所抑制。通过对分子自噬通量的研究，我们发现ISKNV可以通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路诱导自噬，并且在感染后第3天和第5天，ISKNV还通过ULK-1的Serine 555和Serine 757位点的磷酸化参与自噬过程。此外，我们还发现ISKNV可以显著增强BECN1/p62（SQSTM1）信号通路，但这些信号通路在感染后第3天和第5天也都受到DHA处理的调节。最后，DHA处理能够抑制病毒基因和的表达，这与ISKNV感染GF-1细胞后第3天和第5天的病毒滴度分别降低了20倍和5.3倍相关。综合这些结果，表明DHA处理可以通过AMPK/mTOR/ULK1和BECN1/SQSTM1信号通路影响自噬通量，从而降低病毒基因表达和病毒复制。这一发现可能为大型DNA病毒感染的治疗提供新的见解。
引言
多种不同的病毒在感染过程中会主动诱导细胞死亡，包括凋亡或坏死，这些细胞死亡方式在病毒性疾病的发病机制中起着关键作用[1]。其中一种病毒导致了全球两栖动物数量的严重下降，并给水产养殖业带来了巨大的经济损失[2]、[3]。虹彩病毒属于一个大型双链DNA病毒家族，具有二十面体对称性，直径为120-200纳米。巨细胞病毒可以感染多种热带海洋和淡水鱼类，如石斑鱼、孔雀鱼、慈鲷鱼、红海鲷鱼、天使鱼和灯眼鱼，每种鱼类都会出现类似的疾病症状。在宿主鱼类的感染过程中，Megalocytivirus可以在脾脏、肾脏和胃肠道中找到，而在肝脏、心脏、鳃和结缔组织中的分布较少[4]、[5]。虹彩病毒引起的细胞死亡形式仍在不断被发现，包括典型的凋亡和非凋亡性细胞死亡[6]、[7]、[8]。然而，关于自噬过程的研究还很少。
自噬是一种针对细胞内微生物的防御机制，通过将细胞内微生物融合到溶酶体中进行降解[9]。自噬有助于激活先天抗病毒免疫[10]、[11]，并通过将病毒衍生的肽类物质传递给淋巴细胞，由主要组织相容性复合体分子呈递，从而参与适应性免疫反应[12]、[13]、[14]。mTORC1是一种蛋白激酶，它通过刺激蛋白质合成和抑制自噬的诱导来调节自噬[15]。在哺乳动物细胞中，5′AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是mTORC1的主要上游调节因子。此外，AMPK信号还可以通过磷酸化ULK1的Serine 555位点来诱导自噬过程[16]。最近的研究表明，mTOR激活可以通过介导ULK1的Serine 757位点磷酸化来调节unc-51样自噬，从而阻止自噬的启动[17]。
最近，Hsueh等人（2024年）报告了ISKNV通过ROS介导的应激信号，在GF-1细胞中通过AMPK/mTOR途径诱导自噬的分子机制[18]。此外，关于自噬对ISKNV感染的影响及其与病毒复制的相关性的研究仍然相对较少，因此发现有效的化合物和药物是一个紧迫的任务。
DHA是一种必需脂肪酸；因此，它不能通过细胞自身的合成途径产生，必须通过饮食获取，主要通过食用冷水鱼或其油脂，或者通过α-亚麻酸的代谢途径[19]。DHA对于维持生物体内多种细胞类型的正常功能至关重要，能够预防心血管疾病，并对视网膜细胞的存活产生积极影响[20]、[21]。此外，DHA在生物体内的核心作用还与神经保护相关，可以延长神经细胞的寿命，减少神经退化、炎症和认知衰退[22]。另一方面，ω-3多不饱和脂肪酸也被报道对凋亡性细胞死亡有影响。DHA在体外抑制了MCF-7乳腺癌细胞的存活率，并通过诱导凋亡促进细胞死亡。它还降低了B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）的表达，同时增加了Bcl-2相关X蛋白的表达。DHA还促进了Smac/Diablo和细胞色素c从线粒体的释放，并提高了caspase-8、-9和-3的活性[23]。最近，DHA被用作某些DNA[24]、[25]和RNA病毒[26]、[27]的抗病毒化合物，但关于其自噬机制的研究仍然较少。
关于DHA对鱼类系统影响的研究很少，尤其是在涉及病毒感染的情况下。在这项研究中，我们探讨了ISKNV是否通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路以及BECN1/p62（SQSTM1）表达水平来诱导自噬，这些通路会受到PUFA（DHA）处理的调节。这些发现可能为巨细胞病毒的控制和治疗提供新的见解。
实验方法
使用的化学物质和药物
实验中使用了MDC染色试剂盒（ab133075，abcam）和DHA（Sigma Aldrich, Inc.）。
药物处理
二十二碳六烯酸（DHA）由Sigma Aldrich, Inc.提供。在旨在研究选择性阻断细胞死亡的实验中，细胞先被DHA处理两小时，然后进行虹彩病毒感染。
细胞培养和病毒
石斑鱼鳍细胞（GF-1细胞）由Chi博士（动物学与生命科学研究所）提供。这些细胞在标准条件下进行培养
DHA处理可以提高GF-1细胞中的宿主细胞存活率
在筛选DHA剂量对宿主细胞存活率的影响时，我们测试了不同的剂量，即0.4 μM、2 μM、10 μM和50 μM，在感染ISKNV的GF-1细胞中（见补充材料1和2）。DHA处理结果显示，10 μM的剂量优于其他剂量，因此我们将其作为最佳条件。根据DHA处理的结果（图1），在感染后第1天、第3天和第5天，DHA处理显著提高了宿主细胞的存活率（图1A，DHA浓度为10 μM）
讨论
在亚洲，虹彩病毒，特别是巨细胞病毒，已经对多种具有经济价值的海洋鱼类和淡水鱼类造成了严重的经济损失[3, 4, 7]。尽管其经济影响严重，但巨细胞病毒的分子发病机制研究仍然不足。在这项研究中，我们探讨了ISKNV是否通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路在感染早期至中期（第3天）诱导宿主细胞自噬
作者贡献
K.-W.C.、C.-F H和J.-R.H.设计了研究并提出了概念；K.-W.C.、J.-L. W.和J.-R.H.进行了研究并参与了讨论；J.-R.H.撰写了论文。所有作者都阅读并同意了发表的手稿版本。
资助
本研究得到了台湾国家科学技术委员会授予Jainn-Ruey Hong的资助（AS-109-ITAR-L08）。
致谢
本研究得到了台湾国家科学技术委员会授予Jainn-Ruey Hong的资助（NSC 98-2313-B-006-004-MY3和NSC 101-3011-P-006-006）。
作者感谢S.C. Chi（台湾动物学与生命科学研究所）提供了石斑鱼鳍细胞系，以及C. M. Wen博士（台湾高雄国立大学生命科学系）提供了RSIV-KU病毒株。
