血浆来源的Streptococcus parauberis诱导的橄榄比目鱼（Paralichthys olivaceus）外泌体对Streptococcus parauberis的免疫调节作用
《Fish & Shellfish Immunology》：Immunomodulatory Effect of Plasma-derived
Streptococcus parauberis Challenged Olive Flounder (
Paralichthys olivaceus) Exosomes against
Streptococcus parauberis
编辑推荐：
欧洲鲈鱼感染性parauberis链球菌病研究中，外泌体Sp-Exo通过RNA测序（21,581基因）发现1,182个差异表达基因，免疫相关通路（PI3K-Akt、MAPK）显著上调，心肌病通路下调，Sp-Exo处理组50%存活率及病理学分析证实其免疫调节和疫苗开发潜力。
E.H.T. 图尔尚·贾亚蒂拉卡（E.H.T. Thulshan Jayathilaka）| 马哈纳玛·德·佐伊萨（Mahanama De Zoysa）| 查米拉尼·尼卡皮蒂亚（Chamilani Nikapitiya）
韩国大田市儒城区忠南国立大学兽医学院及兽医医学研究所，邮编34134
摘要
本研究探讨了由Streptococcus parauberis感染后的橄榄比目鱼（Paralichthys olivaceus）血浆中提取的外泌体（Sp-Exo）的转录组学效应和免疫调节作用，以及其在赋予疾病抵抗力方面的潜在作用。通过对接受Sp-Exo处理的橄榄比目鱼肾脏进行RNA测序，共鉴定出21,581个基因，其中1,182个基因表现出显著差异表达。功能注释显示，上调基因主要涉及免疫相关通路，如粘附聚集、PI3K-Akt和MAPK信号通路；而下调基因则与心肌病相关通路相关。为了评估Sp-Exo的免疫调节效果，研究人员将橄榄比目鱼腹腔注射PBS（对照组）、Sp-Exo或PBS-Exo，随后用S. parauberis（4.2 × 108 CFU/鱼）进行感染。感染后4天（dpc），对肾脏组织进行qRT-PCR分析发现，与对照组相比，Sp-Exo组中免疫相关基因（TLR5a、IL1β、TNFα和IL8）的表达显著上调（>1.5倍）。此外，Sp-Exo处理组有50%的鱼存活（RPS：50%）。组织病理学分析表明，Sp-Exo处理组的鱼类结构损伤和炎症病变减轻，这支持了其作为保护因子的作用。这些发现突显了Sp-Exo的免疫调节特性及其作为预防橄榄比目鱼S. parauberis感染的候选疫苗的潜力。进一步阐明Sp-Exo在宿主细胞内的内化机制将有助于理解宿主-病原体相互作用，并为水产养殖领域开发新的预防策略提供有益见解。
引言
细胞外囊泡（EVs）已成为免疫调节和疾病管理的有希望的候选物质[1]。这些纳米级的脂质双层膜囊泡由大多数细胞类型分泌，在细胞间通讯中发挥关键作用[2]。根据2023年细胞外囊泡研究最低信息（MISEV2023）指南，EVs根据其大小、密度、生化组成和细胞来源进行分类，主要分为小（<200 nm）和中（>200 nm）两个亚类[3]。其中，外泌体作为小EVs的一个子集，具有特定的生物生成机制、分泌途径和标记蛋白[4]。外泌体广泛存在于生物液体中，如血浆、尿液、唾液和母乳中，其功能不仅限于废物清除，还参与重要的生理过程，包括免疫调节[5]。它们的 cargo 包括蛋白质、DNA、mRNA、microRNAs（miRNAs）和脂质，这些成分决定了它们的生物学功能[6]。在正常情况下，外泌体通过向靶细胞传递分子信号来介导细胞间通讯。在感染或组织损伤的情况下，它们参与免疫调节、抗原呈递、免疫细胞（巨噬细胞、T细胞和B细胞）激活以及组织修复[7]。由于这些特性，外泌体在生物医学研究中受到广泛关注，应用于靶向药物递送、疾病诊断、伤口愈合和疫苗开发等领域[8]。
橄榄比目鱼（Paralichthys olivaceus）是韩国养殖最广泛的鱼类，因其高市场需求和食用价值[9]。然而，集约化养殖导致该鱼类易受多种传染病的侵袭，带来了严重的经济和生态挑战[10]。其中最严重的威胁是链球菌病，主要由革兰氏阳性细菌病原体引起，包括Streptococcus iniae、S. parauberis和S. agalactiae。这种感染会导致高死亡率，给水产养殖业造成巨大损失[11]。传统的抗生素治疗因多重耐药S. parauberis菌株的出现而失效[12]。尽管已开发出针对不同血清型的疫苗策略，但其效果仍不稳定[13]。因此，探索创新方法对于控制现有的和新兴的S. parauberis感染至关重要，尤其是在橄榄比目鱼养殖中。
疫苗接种是一种关键的医学进展，它通过训练免疫系统识别和消除病原体来预防传染病[14]。先天免疫系统通过激活适应性免疫提供第一道防线，从而产生长期的免疫记忆，通过B细胞抗体和T细胞反应实现[15]。再次暴露于病原体时，记忆细胞会触发快速的免疫反应，防止感染。利用外泌体诱导针对细菌感染的保护性免疫在免疫疗法中受到关注[16]。在之前的研究中，我们证明了来自S. parauberis感染橄榄比目鱼血浆的外泌体（Sp-Exo）具有多种生物学活性，包括免疫调节、伤口愈合和疾病抵抗力[11]、[17]。鉴于其免疫调节潜力，Sp-Exo可能成为控制橄榄比目鱼S. parauberis感染的新治疗策略。本研究通过RNA测序（RNA-Seq）探讨了Sp-Exo处理的转录组反应、免疫调节效果、疾病抵抗力及组织病理学效应，以揭示其在水产养殖疾病管理中的潜在应用。
实验部分
Sp-Exo和PBS-Exo的处理、S. parauberis感染及样本收集
PBS-Exo（来自注射PBS的鱼）和Sp-Exo（来自S. parauberis感染的鱼）是从S. parauberis感染的橄榄比目鱼中分离得到的，并已通过Jayathilaka等人的先前研究进行了全面表征[11]、[12]。在本研究中，使用这些经过充分表征的PBS-Exo和Sp-Exo来确认并进一步阐明它们在免疫调节、疫苗潜力和疾病抵抗力方面的分子水平作用。
橄榄比目鱼肾脏的转录组谱型和差异表达基因
为了研究Sp-Exo诱导产生的全部RNA转录本，我们对接受PBS-Exo和Sp-Exo处理的橄榄比目鱼肾脏进行了转录组分析。经过初步清洗和过滤后，分别获得了24,072,554个和24,082,628个干净的读段，平均Q20值分别为98.13%和97.95%。PBS-Exo和Sp-Exo的过滤数据与P. olivaceus参考基因组进行了比对。
讨论
在之前的研究中，我们证明了Sp-Exo处理在体外能够诱导免疫基因表达，增强斑马鱼对细菌感染的免疫反应[12]。为了进一步评估Sp-Exo作为疫苗候选物的潜力，我们首次对橄榄比目鱼进行了全转录组分析，以评估其免疫反应和疫苗效果。
未引用的参考文献
[25]; [26]; [45]
机构审查委员会声明
所有涉及橄榄比目鱼的实验均遵循忠南国立大学动物伦理委员会（202310A-CNU-191）批准的指南和规定进行。
作者贡献声明
E.H.T. 图尔尚·贾亚蒂拉卡（E.H.T. Thulshan Jayathilaka）：方法学设计、实验实施、数据分析、初稿撰写及审稿编辑。
查米拉尼·尼卡皮蒂亚（Chamilani Nikapitiya）：概念构思、资金获取、项目管理、监督、方法学设计、审稿编辑。
马哈纳玛·德·佐伊萨（Mahanama De Zoysa）：概念构思、项目管理、监督、资源调配、审稿编辑。
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助（项目编号：RS-2024-00347938），以及韩国教育部通过NRF支持的基础科学研究计划（项目编号：RS-2021-NR060136）的资助。
