wssv025基因在白点综合症病毒（White Spot Syndrome Virus）对单节对虾（Penaeus monodon）致病性中的功能分析

《Fish & Shellfish Immunology》：Functional Analysis of wssv025 Gene in the Pathogenicity of White Spot Syndrome Virus in Penaeus monodon

白斑综合征病毒（WSSV）的wssv025基因通过酵母双杂交（Y2H）与多个病毒蛋白相互作用，调控病毒复制、宿主免疫逃逸及基因表达。RNA干扰沉默wssv025显著降低vp28、icp11、ie1等关键基因的转录和翻译水平，Western blot验证了病毒蛋白表达下降。组织特异性分析显示，wssv025在附肢和血细胞中的表达调控具有差异。该研究证实wssv025是WSSV致病性核心调控因子，为RNAi靶向治疗提供了理论依据。

　　白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus, WSSV）是一种极具致病性的病原体，对虾类水产养殖业造成严重的经济损失。尽管已有大量研究，但某些病毒基因如 *wssv025* 在病原机制中的具体作用仍不明确。本研究通过综合使用酵母双杂交（Y2H）和小干扰RNA（dsRNA）沉默技术，探讨 *wssv025* 在WSSV病原机制中的作用及其作为抗病毒策略的潜在价值。研究结果表明，*wssv025* 蛋白与多个关键病毒蛋白存在相互作用，提示其在病毒复制、免疫逃逸和宿主调控中发挥重要作用。通过 *wssv025* 基因沉默，主要WSSV基因如 *vp28*、*icp11* 和 *ie1* 的转录和翻译水平显著下降。西方印迹分析进一步验证了这些发现，表明 *wssv025* 基因沉默可有效降低病毒蛋白的表达水平。此外，通过分析病毒基因组拷贝数在附肢（pleopods）中的变化以及血细胞（hemocytes）中病毒基因的表达，发现 *wssv025* 在组织水平上具有特定的响应模式。这些结果突显了病毒复制、宿主免疫反应和基因表达之间的复杂关系。本研究为基于RNAi的抗病毒策略提供了有力证据，表明 *wssv025* 可能成为控制WSSV感染的一种潜在治疗手段。

虾类水产养殖在全球海产品市场中占据重要地位，其中 *Penaeus monodon*（巨虎虾）和 *Litopenaeus vannamei*（凡纳滨对虾）是最常见的养殖品种，因其市场需求高而被广泛养殖。在过去几十年中，虾类养殖业经历了显著的发展，不仅有助于粮食安全，还促进了经济繁荣，尤其是在亚洲和拉丁美洲等地区。然而，尽管取得了进展，虾类养殖仍然面临由疾病爆发带来的重大挑战，其中WSSV是最严重的威胁之一。WSSV是引起养殖虾白斑病的主要病原体，能够在感染后3至10天内导致全群死亡。这种病毒属于 *Nimaviridae* 家族中的 *Whispovirus* 属，具有极强的致病能力。为控制WSSV感染，已探索了多种策略，包括环境控制、草药治疗、重组疫苗和RNA干扰（RNAi）等。然而，由于对WSSV病原机制和病毒-宿主相互作用的理解有限，有效的预防和治疗方法仍显不足。研究表明，WSSV的基因组中包含532个预测的开放阅读框（ORFs），其中一些关键基因在病毒感染、免疫逃逸和复制过程中发挥重要作用。例如，*vp28* 和 *icp11* 是两个已被广泛研究的基因，它们在WSSV的致病性中起着至关重要的作用。*vp28* 是一种主要的包膜蛋白，对于病毒的感染起着关键作用，它通过介导与宿主细胞的结合和促进病毒通过内吞作用进入细胞。由于其在病毒感染中的核心作用，*vp28* 已被广泛研究作为基于RNAi的抗病毒策略的潜在靶点。研究发现，针对 *vp28* 的dsRNA可以有效减少病毒复制并提高虾类的存活率，使其成为控制WSSV感染的一种有前景的手段。

*icp11* 是另一种在WSSV中起关键作用的毒力因子，它被识别为一种DNA模拟物，能够与宿主组蛋白蛋白（如H2A、H2B、H3和H2A.x）相互作用。这种结合会干扰DNA与组蛋白之间的正常相互作用，从而影响核小体的组装。这种染色质结构的破坏可能会抑制宿主基因的转录和DNA修复机制，促进病毒复制并加剧疾病的发展。由于其与宿主核小体的强效相互作用，*icp11* 被认为是WSSV感染中最强大的毒力因子之一。通过RNAi或免疫策略针对 *icp11* 的研究显示，这可能有助于减少WSSV引起的虾类死亡率。另一方面，*ie1* 是WSSV的一个早期基因，它在病毒转录调控和复制过程中起着重要作用。作为关键的调控蛋白，*ie1* 被认为是转录激活因子，能够促进早期和晚期WSSV基因的表达。它还被发现能够与宿主细胞通路相互作用，可能调节宿主免疫反应并促进病毒复制。研究表明，*ie1* 可能通过增强结构和非结构基因的转录来促进病毒的致病性，这些基因对于WSSV的致病过程至关重要。因此，*ie1* 在病毒生命周期中具有关键作用，可能是基于RNAi的抗病毒策略在虾类水产养殖中的潜在靶点。

近年来，对WSSV的理解和管理取得了显著进展。新兴的抗病毒策略包括RNAi、基于CRISPR的基因编辑、益生菌和抗病毒肽等，这些方法在缓解WSSV感染方面展现出潜力。针对关键病毒基因如 *vp28* 和 *icp11* 的RNAi治疗已被证明能够有效抑制病毒复制并提高感染虾类的存活率。此外，新型疫苗策略，如使用病毒样颗粒（VLPs）和基于纳米颗粒的dsRNA递送系统，也被开发出来以增强虾类对WSSV的免疫反应。这些方法的出现为控制WSSV感染提供了新的思路和工具。

在抗病毒先天免疫的研究中，科学家们致力于揭示免疫系统如何检测和响应病毒感染。作为机体的第一道防线，先天免疫反应对于限制病毒复制和防止感染扩散至关重要。在研究病毒与宿主相互作用的分子机制方面，酵母双杂交（Y2H）是一种强有力的工具。Y2H实验通常通过报告基因检测方法（如抗性选择和蓝白筛选）来验证蛋白质相互作用。这些方法被广泛用于检测相互作用蛋白、分析其相互作用机制并确认特定的蛋白质-蛋白质相互作用。在抗病毒先天免疫研究中，Y2H技术有助于揭示新的信号通路，并加深对调控抗病毒反应的网络的理解。此外，Y2H分析还揭示了多种在病毒感染后被激活的先天免疫调控网络节点。

Y2H技术在揭示WSSV与宿主蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用方面发挥了重要作用。在一项研究中，Y2H被用于筛选WSSV蛋白与虾类乳酸脱氢酶（LvLDH1和LvLDH2）之间的相互作用，最终发现了 *wssv004* 作为直接相互作用蛋白。这种早期病毒蛋白被证明能够在类似囊泡的细胞结构中与LvLDH共定位，并通过蛋白质-蛋白质相互作用调节LDH活性和WSSV复制。另一项研究通过构建WSSV蛋白质-蛋白质相互作用图谱，结合Y2H和共免疫沉淀（CoIP）技术，揭示了多个协调病毒过程的病毒枢纽蛋白。此外，Y2H技术也被用于研究虾类SIRT4蛋白，其中提出了蛋白质相互作用网络以解释通过未知WSSV蛋白间接调节谷氨酰胺脱氢酶（LvGDH）的机制。综上所述，Y2H系统已被用于揭示WSSV与宿主蛋白之间的相互作用，为深入理解病毒致病机制和免疫逃逸提供了重要线索。由于一些WSSV基因，包括 *wssv025*，的具体功能仍未完全阐明，本研究旨在通过结合Y2H和dsRNA沉默技术，进一步研究 *wssv025* 在WSSV病原机制中的作用，以期为控制虾类养殖中的WSSV爆发提供新的抗病毒策略。

本研究的Y2H筛选结果显示，*wssv025* 与多种WSSV蛋白存在显著的相互作用。这些相互作用在特定的筛选培养基上得到了验证，酵母的生长和报告基因的激活（如蓝色染色）表明了 *wssv025* 与这些蛋白之间的结合。大多数测试的蛋白均显示出与 *wssv025* 的强效相互作用，这通过在严格筛选培养基上酵母的强健生长和明显的蓝色染色得到了证实。通过Y2H筛选，研究者发现 *wssv025* 与多种病毒蛋白存在相互作用，这些蛋白包括包膜蛋白（如 *vp41a* / *wssv293*）和衣壳蛋白等。这些相互作用为理解 *wssv025* 在病毒生命周期中的作用提供了重要线索。

在讨论部分，研究者指出生物信息学和蛋白质组学在识别宿主-病原体相互作用和潜在治疗靶点方面发挥了关键作用。Y2H系统已被用于揭示WSSV与宿主蛋白之间的相互作用，为深入理解病毒致病机制和免疫逃逸提供了重要信息。本研究中，以 *wssv025* 为诱饵的Y2H筛选揭示了多种病毒相互作用蛋白，包括包膜蛋白和衣壳蛋白等。这些发现表明 *wssv025* 在病毒复制和宿主调控中具有重要作用。此外，通过 *wssv025* 基因沉默对病毒基因表达的影响进一步支持了这一观点。这些结果为基于RNAi的抗病毒策略提供了有力证据，表明 *wssv025* 可能成为控制WSSV感染的一种潜在治疗手段。

在结论部分，本研究确认了 *wssv025* 在WSSV病原机制中的关键作用。*wssv025* 与重要病毒蛋白之间的相互作用，以及其基因沉默对病毒基因表达的影响，表明 *wssv025* 可能成为基于RNAi的抗病毒策略的有力靶点。未来的研究应进一步阐明 *wssv025* 在调节病毒基因表达中的具体分子机制，并评估其在体内环境中的抗病毒效果。这些研究将有助于开发更有效的抗病毒方法，以控制虾类养殖中的WSSV感染，提高养殖效益和虾类存活率。

本研究的作者贡献声明指出，Shanel G. Manito负责研究方法、数据整理、验证、形式分析、调查和撰写初稿；Cong-Yan Chen负责研究方法、数据整理、形式分析、调查、监督和撰写审阅与编辑；Brandon Rafael de Jesús Castillo-Corea负责研究方法、数据整理、形式分析、调查和监督；Mary Nia M. Santos负责监督、资金获取、项目管理、撰写审阅与编辑；Casiano H. Choresca负责验证；Christopher Marlowe Caipang负责调查；Han-Ching Wang负责调查；Fernand F. Fagutao负责调查。这些贡献体现了团队成员在不同研究环节中的协作与分工，共同推动了本研究的完成。

本研究的数据可用性声明指出，研究数据将在请求时提供。这表明研究者愿意与同行分享实验数据，促进科学研究的透明度和可重复性。同时，研究者也提到，该研究在台湾的国际水产养殖科学开发中心，生物技术与生物产业系，国立成功大学，台南市进行，并得到了台湾国家科学与技术委员会（Grant Numbers: NSTC 113-2628-B-006-003 和 NSTC 113-2923-B-006-002-MY2）以及台湾教育部的“高教深耕计划”支持。这些资金支持为研究提供了必要的资源和条件，确保了实验的顺利进行。

本研究的术语表提供了相关缩写的定义，如AD代表“Prey Plasmid”（猎物载体），AH109代表“*Saccharomyces cerevisae* 酵母菌株AH109”，BD代表“Bait Plasmid”（诱饵载体），DNA代表“Deoxyribonucleic Acid”（脱氧核糖核酸），EF1α代表“Translation elongation factor 1-alpha”（翻译延伸因子1-alpha），KCl代表“Potassium Chloride/Salt”（氯化钾/盐），KH?PO?代表“Potassium Dihydrogen Phosphate”（磷酸二氢钾），LB代表“Luria-Bertani Broth/Agar”（LB培养基/琼脂），LiAC代表“Lithium Acetate”（乙酸锂），Luc代表“Luciferase”（荧光素酶），Min-Trp代表“Minimal SD Agar Base”（最小SD琼脂基），NaOAc代表“Sodium Acetate”（醋酸钠），Na?HPO?代表“Sodium Hydrogen Phosphate”（磷酸氢钠），NCBI代表“National Center for Biotechnology Information”（美国国家生物技术信息中心），ORFs代表“Open Reading Frames”（开放阅读框），PBS代表“Phosphate-buffered Saline”（磷酸盐缓冲液），PCR代表“Polymerase Chain Reaction”（聚合酶链式反应），PEG-3350代表“Polyethylene Glycol 3350”（聚乙二醇3350）。这些术语的定义有助于读者更好地理解研究中使用的实验方法和相关概念。

综上所述，本研究通过系统的实验方法，揭示了 *wssv025* 在WSSV病原机制中的重要作用。研究结果不仅加深了对病毒与宿主相互作用的理解，还为开发基于RNAi的抗病毒策略提供了新的思路和证据。这些发现对于提高虾类水产养殖的可持续性和减少经济损失具有重要意义。同时，研究团队的合作与贡献，以及数据的可用性，也为未来相关研究奠定了基础。随着对病毒基因功能的进一步研究，基于RNAi的抗病毒策略有望成为控制WSSV感染的有效手段，从而改善虾类养殖业的现状。