热休克转录因子调控Portunus trituberculatus中crustin基因的表达

《Fish & Shellfish Immunology》：The heat shock transcription factor regulates the expression of crustin in Portunus trituberculatus

本研究鉴定了青蟹中新型热休克转录因子PtHSF，揭示其通过DNA结合域调控抗菌肽Ptcrustin1表达，并发现His66、Arg103、Lys104三个氨基酸残基与启动子区非共价结合，为青蟹病害防控提供新视角。

　　

吴一静|张毅|郑金斌|崔赵霞

宁波大学海洋科学学院，中国宁波，315211

摘要

转录因子是免疫信号转导中的关键调控成分。为了发现能够调节甲壳类动物抗菌肽表达的新转录因子，我们对Portunus trituberculatus中的热休克转录因子（HSF）进行了鉴定，并研究了其在抗菌肽表达中的调控作用。PtHSF具有HSF家族的典型结构特征，包括一个DNA结合域（DBD）、疏水重复序列（HR-A/B）和一个核定位信号（NLS）。PtHSF在多种组织中广泛表达，在肌肉中的表达量尤为丰富。尽管Vibrio alginolyticus的刺激在12小时内不会显著改变P. trituberculatus的血细胞中PtHSF的表达水平，但PtHSF能够特异性地调控血细胞中Ptcrustin1的表达。此外，分子对接模拟显示，PtHSF的DBD中的三个氨基酸（His66、Arg103和Lys104）通过非共价相互作用（如氢键和范德华力）与Ptcrustin1的启动子序列结合。本研究丰富了我们对甲壳类动物抗菌肽表达调控机制的理解，并为P. trituberculatus水产养殖中的疾病控制提供了新的视角。

引言

Portunus trituberculatus是中国蟹类养殖业的主要物种，具有重要的经济价值[1]。然而，在养殖过程中，各种生物和非生物胁迫因素经常对其养殖造成重大损失，成为可持续产业发展的主要瓶颈[2]。致病性Vibrio物种是导致P. trituberculatus水产养殖中细菌性疾病的主要生物胁迫因素[[3], [4], [5]]。免疫学研究对于应对疾病挑战至关重要，因此，研究P. trituberculatus的免疫防御机制对于指导疾病预防和改善当前的水产养殖业状况非常重要。

作为无脊椎动物，P. trituberculatus完全依赖先天免疫机制来对抗病原体[6,7]。近十年来，在揭示P. trituberculatus的免疫特性方面取得了显著进展，包括鉴定出多种抗菌肽和经典的免疫信号通路[[8], [9], [10]]。作为甲壳类动物免疫的核心效应分子，抗菌肽的合成受到多种免疫信号因子的调控。目前的研究主要集中在核因子-kappa B（NF-kB）信号通路上，阐明了转录因子dorsal和relish在调节抗菌肽表达中的作用[[11], [12], [13]]。然而，仍存在关键的知识空白：控制抗菌肽表达的非经典调控通路和转录因子尚未得到充分探索。鉴于疾病爆发与环境胁迫之间的关联[14,15]，识别同时具有抗病性和耐胁迫性的双重功能调控因子至关重要。

热休克转录因子（HSF）是一类普遍存在于各种生物体中的转录调控因子，它们通过协调热应激下基因的表达来介导热休克反应[16,17]。重要的是，HSF不仅调控细胞对环境逆境的适应，还在免疫调节中发挥关键作用，展示了其在应激适应性和免疫稳态中的多重功能[18]。先前的研究表明，HSF-1能够增强免疫能力，并且对Caenorhabditis elegans抵御多种病原体至关重要[19]。而在Epinephelus coioides中，HSF1反而支持病毒感染[20]。在Marsupenaeus japonicus中，HSF1通过诱导NF-κB和Jak/Stat通路的负调控因子的表达来抑制氨胁迫下的抗病毒免疫[21]。鉴于HSF在免疫调节功能上的物种间差异，以及关于甲壳类动物中HSF研究的相对匮乏，迫切需要开展对这些生物体中HSF免疫调节功能的研究。

本研究探讨了一种新的HSF（PtHSF）对游泳蟹P. trituberculatus中抗菌肽表达的调控作用。首先分析了PtHSF的分子特征和表达特性，随后确定了PtHSF对抗脂多糖因子（ALFs）和crustins的转录调控作用，最后模拟了PtHSF与Ptcrustin启动子之间的相互作用。本研究将有助于我们更好地理解甲壳类动物中抗菌肽表达的调控机制，为后续针对P. trituberculatus的基于HSF的疾病预防和控制策略的研究奠定基础。

部分摘要

动物和样本采集

蟹类从中国浙江省宁波市的一个水产养殖场购买。蟹类被饲养在矩形水箱（60厘米×40厘米×25厘米）中，每箱饲养5只。蟹类在25°C的温度和30‰的盐度海水中适应5天，海水每天更换。适应期间，每天喂食两次虾。采集的组织包括肌肉、胃、肝胰腺、肠道、鳃、心脏、血细胞、眼柄等。

PtHSF的序列特征

PtHSF的全长cDNA（GenBank: PV658101）由1079个核苷酸组成，5′-非翻译区（UTR）为81个核苷酸，3′-UTR为146个核苷酸。PtHSF的开放阅读框（ORF）包含852个核苷酸，编码283个氨基酸，N末端有一个DNA结合域（N9-K112），随后是疏水重复序列（HR-A/B）（L165-N178, I189-L197）和核定位信号（NLS）（P210-H216）（图1）。氨基酸序列相似性分析表明，DBD和HR-A/B...

讨论

通常认为HSF是调节热休克蛋白表达的主要调控因子[32,33]。有趣的是，越来越多的证据表明HSF具有超出热休克反应的多重功能[18]。为了深入理解HSF的免疫调控功能，本文首次报道了HSF在P. trituberculatus中抗菌肽表达中的调控作用。在P. trituberculatus中鉴定出一种新的HSF，它表现出典型的...

结论

总之，在P. trituberculatus中鉴定出一种具有抗菌肽转录调控功能的新HSF。我们的研究发现PtHSF特异性地促进了Ptcrustin1的表达。此外，PtHSF通过非共价相互作用与Ptcrustin1的启动子结合，预测有三个氨基酸参与了这种相互作用。我们的研究不仅推进了了对HSF免疫调控功能的理解，还为...

CRediT作者贡献声明

吴一静：研究、正式分析、撰写初稿。张毅：方法学、资金获取。郑金斌：概念构思、撰写-审稿与编辑、资金获取。崔赵霞：监督。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了宁波市自然科学基金（2023J108和2024J171）、CPSF博士后奖学金计划（GZC20252060）以及宁波大学的K. C. Wong Magna基金的支持。