《Fish & Shellfish Immunology》：Functional assessment of European sea bass RTP3 proteins and their effect on RGNNV replication
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欧洲海鲈鱼RTP3 X1和X2蛋白通过抑制mx和tnf-α基因表达、增强氧化应激耐受（X1更显著）以及诱导凋亡（X1独有）影响抗RGNNV活性，X2具抗病毒性而X1呈现促病毒效应。
帕特里夏·莫雷诺（Patricia Moreno）| 丹尼尔·阿尔瓦雷斯-托雷斯（Daniel Alvarez-Torres）| 埃丝特·加西亚-罗萨多（Esther Garcia-Rosado）| 朱莉娅·贝哈尔（Julia Bejar）| M. 卡门·阿隆索（M. Carmen Alonso）
马拉加大学（Universidad de Málaga），微生物学系（Departamento de Microbiología），理学院（Facultad de Ciencias），邮编29071，马拉加，西班牙
摘要
RTP3蛋白似乎在欧洲海鲈（European sea bass）对NNV感染的先天免疫反应中起着重要作用，但其具体机制尚不清楚。本研究全面探讨了欧洲海鲈RTP3蛋白（RTP3 X1和RTP3 X2）的抗RGNNV活性，并探索了几种可能的作用机制。作为研究起点，将海鲈的rtp3 X1和rtp3 X2基因克隆到表达载体中，并转染到E?11细胞系中，以获得稳定表达RTP3 X1和/或RTP3 X2的细胞。实验结果表明，RTP3 X2具有抗病毒作用，而RTP3 X1则具有促病毒作用。功能评估显示，这两种蛋白（单独或共同表达）均能抑制mx和tnf-α基因的诱导，并增强细胞对氧化应激的耐受性，其中RTP3 X1表达细胞的耐受性尤为显著。此外，只有RTP3 X1能促进未感染细胞的凋亡。因此，凋亡和氧化应激耐受性可能与RTP3 X1的促病毒作用有关。
这些结果表明，欧洲海鲈的RTP3 X1和RTP3 X2是多功能蛋白，可能影响多种细胞功能，为进一步研究其作用机制提供了基础。
引言
受体转运蛋白3（RTP3）属于受体转运蛋白家族（RTP），其生物学作用尚不明确。在哺乳动物中，RTP3被描述为一种肿瘤抑制蛋白，与骨组织结构不稳定有关，并在干扰素（IFN）-α的作用下表达[1]。在鱼类中，rtp3基因被发现在大西洋鲑鱼（Salmo salar）中对多种病毒感染有强烈诱导反应[2,3]，同时在塞内加尔鳎鱼（Solea senegalensis）、亚洲海鲈（Lates calcarifer）和欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）感染神经坏死病毒（NNV）后也有所表达[4,5,6]。此外，亚洲海鲈rtp3基因3′非编码区的一个微卫星区域存在的差异与该物种对NNV感染的抵抗力显著相关[7]。综合这些发现，该基因在调节NNV感染进程中的潜在作用仍有待进一步验证。
NNV（属于Betanodavirus属）是引起病毒性神经坏死（VNN）的病原体，这种疾病会影响多种养殖鱼类，尤其是幼体和幼鱼阶段，导致高死亡率。NNV基因组由两个单链正义RNA片段组成：RNA1（编码病毒聚合酶）和RNA2（编码衣壳蛋白CP）。此外，还从RNA1的3′端合成一种亚基因组RNA（RNA3，编码非结构蛋白B1和B2）[8]。根据RNA2片段中的变异区域，NNV被分为四种具有不同宿主特异性的基因型[9]。迄今为止，在欧洲海鲈中仅检测到条纹杰克鱼神经坏死病毒（SJNNV）和红点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）这两种基因型，其中只有RGNNV与自然暴发相关，给水产养殖业带来了重大经济损失[10]。
在欧洲海鲈中发现了两个rtp3基因（rtp3 X1和rtp3 X2）[11]。这两个基因的序列相似度较低（63.5%），并在接种RGNNV分离株、细菌脂多糖（LPS）或多聚肌苷：多聚胞苷酸（poly I:C）后，在脑部和头肾中显著上调，因此被归类为干扰素刺激基因（ISGs）。病毒感染时，rtp3 X2在脑部的表达量上调最为显著（变化值为1304倍）[11]。这些基因编码的蛋白质具有67.9%的序列同源性，含有锌结合结构域（所有RTP家族成员中均存在该结构域），但缺乏哺乳动物RTP3蛋白中的跨膜结构域[11]。
欧洲海鲈的RTP3蛋白似乎通过尚未明确的机制在该物种对NNV感染的先天免疫反应中起重要作用。本研究利用稳定表达RTP3 X1和/或RTP3 X2蛋白的E?11细胞，阐明了这两种RTP3异构体的活性和功能机制。
E?11细胞[12]对NNV复制具有高度敏感性，通常在含有10%胎牛血清（FBS）、100单位/mL青霉素和10毫克/mL链霉素（Sigma-Aldrich?，德国）的Leibovitz L-15培养基（Gibco，纽约，美国）中25°C培养至细胞融合。为防止支原体干扰，定期使用噻胺ulin和米诺环素（BM-Cyclin，Roche Diagnostics，S.L.U，瑞士）进行检测和处理。
本研究中使用的三个细胞系是通过数周的抗生素筛选获得的。未经处理的细胞以及经poly I:C刺激或感染RGNNV分离株的细胞均表现出转录的持续性和稳定性。此外，这三个细胞系的生长表现与E?11对照细胞相当（数据未显示）。因此，这些细胞系被认为是适合进一步研究的工具。
本研究首次对欧洲海鲈的RTP3 X1和RTP3 X2进行了功能表征，评估了它们的抗RGNNV活性，并探讨了几种可能的作用机制。这些研究是在体外进行的，使用的是永久转染了欧洲海鲈rtp3基因的E?11细胞。
通过比较RTP3表达细胞和非表达细胞中的病毒复制情况，研究了欧洲海鲈RTP3蛋白的抗病毒活性（单独或联合使用）。
PM：负责研究设计、方法学、撰写论文和编辑工作以及资金申请。DA-T：负责研究设计和方法学。EG-R：负责概念构思、审稿和编辑。JB：负责概念构思、审稿和编辑。MCA：负责概念构思、撰写初稿、监督和资金申请。
本研究得到了西班牙政府项目PID2020-115954RB-I00/AEI/10.13039/501100011033以及安达卢西亚政府经济与知识部/欧盟FEDER 2014–20计划（UMA20-FEDERJA-103）的支持（Junta de Andalucía）。开放获取费用的资助由马拉加大学（Universidad de Málaga/CBUA）提供。
