CDDO-Im激活NRF2可调节人小胶质细胞中的炎症和自噬通路

《Franklin Open》：NRF2 Activation by CDDO-Im Regulates Inflammatory and Autophagy Pathways in Human Microglial Cells

阿尔茨海默病（AD）中NRF2激活剂CDDO-Im通过抑制炎症并促进小胶质细胞自噬发挥作用，RNA-seq和ChIP-seq分析发现IL6、CDK6等炎症相关基因及TFE3、SQSTM1等自噬相关基因是NRF2直接靶点，公共单细胞转录组数据验证了其在AD病理中的调控作用。

　　阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种影响全球数百万老年人的严重神经退行性疾病，其主要特征包括淀粉样蛋白β（amyloid-beta，Aβ）斑块的积累、神经纤维缠结（neurofibrillary tangles）的形成，以及伴随的氧化应激和炎症反应的增强。这些病理变化不仅损害了神经元的正常功能，还导致了认知能力的逐渐下降。近年来，研究者们越来越关注免疫细胞，特别是小胶质细胞（microglia）在AD发病机制中的作用。小胶质细胞作为中枢神经系统（central nervous system，CNS）的驻留免疫细胞，其主要功能是清除脑内的异常物质，包括Aβ斑块和受损神经元。然而，在AD的进展过程中，小胶质细胞的过度激活反而可能引发慢性炎症，从而加剧神经退行性变化。

NRF2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2）是一种重要的转录因子，它在细胞应对氧化应激和炎症反应中起着核心调控作用。在正常生理条件下，NRF2被KEAP1（Kelch-like ECH-associated protein 1）蛋白在细胞质中束缚，并通过泛素化途径被蛋白酶体降解。然而，当细胞遭遇氧化应激或炎症刺激时，NRF2会被释放到细胞核中，进而激活一系列与抗氧化和抗炎相关的基因表达。这种机制在多种神经退行性疾病模型中均显示出显著的保护作用。例如，在AD小鼠模型中，NRF2的遗传激活可以显著降低氧化应激水平，抑制促炎性细胞因子的表达，并减轻神经元的损伤。此外，使用6-MSITC（6-(methylsulfinyl)hexyl isothiocyanate）这一NRF2激活剂，也能够减少Aβ斑块周围的微胶质细胞聚集，从而改善认知功能。

尽管NRF2在AD中的保护作用已被广泛认可，但其在小胶质细胞中的具体调控机制仍然不明确。特别是NRF2如何直接调控小胶质细胞的功能，以及其在AD病理过程中的作用方式，尚需进一步探索。为了填补这一知识空白，本研究采用了一种整合的多组学分析方法，结合定量PCR（qPCR）、RNA测序（RNA sequencing）和染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing，ChIP-seq）技术，系统地分析了NRF2在小胶质细胞中的直接靶基因。研究中使用的人源小胶质细胞系HMC3，是一种具有代表性的人类小胶质细胞模型，能够保留小胶质细胞对炎症刺激的反应能力。

本研究中，NRF2的激活通过使用CDDO-Im（1-[2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oyl] imidazolide）这一合成化合物实现。CDDO-Im是一种咪唑衍生的合成植物三萜类化合物，其结构中包含一个额外的电荷亲和基团，使其在激活NRF2方面表现出比其前体CDDO和另一种衍生物CDDO-Me更强的效果。通过这种化合物，研究团队能够有效模拟NRF2的激活状态，并观察其对小胶质细胞功能的影响。研究结果表明，CDDO-Im的处理显著抑制了由干扰素γ（IFN-γ）或Aβ刺激引发的小胶质细胞炎症反应。这一发现不仅揭示了NRF2在小胶质细胞炎症调控中的作用，还为开发针对AD的新型治疗策略提供了理论依据。

进一步的分析发现，NRF2的激活能够直接调控多个与炎症相关的基因，例如IL6（白细胞介素6）和CDK6（细胞周期依赖性激酶6）。这些基因的表达水平在NRF2激活后显著下降，表明NRF2可能通过抑制这些促炎基因的表达，从而降低小胶质细胞的炎症活性。此外，研究还发现了与自噬（autophagy）相关的五个NRF2直接靶基因，如TFE3（transcription factor EB）和SQSTM1（sequestosome 1）。自噬是细胞内一种重要的降解机制，能够清除异常蛋白聚集物，如Aβ和tau蛋白。在AD患者中，自噬通路的异常已被广泛报道，表现为自噬体和自噬溶酶体的异常积累，这提示自噬功能的受损可能在AD的发病过程中起着关键作用。因此，NRF2通过促进自噬相关基因的表达，可能有助于清除这些有害蛋白，从而延缓疾病进展。

研究团队还利用公共的单细胞转录组数据进一步验证了NRF2在AD小胶质细胞自噬调控中的作用。这些数据表明，在AD大脑中，小胶质细胞的自噬能力与NRF2的表达水平密切相关。这不仅强调了小胶质细胞在NRF2介导的自噬调控中的核心地位，还揭示了NRF2可能在维持神经系统的稳态中发挥重要作用。值得注意的是，NRF2的双重调控功能——同时抑制炎症反应并促进自噬过程——为理解其在AD中的作用机制提供了新的视角。

在本研究中，除了对NRF2靶基因的识别，还深入探讨了NRF2激活对小胶质细胞功能的影响。例如，CDDO-Im的处理不仅降低了炎症因子的表达，还增强了自噬相关蛋白（如LC3-II/LC3-I）的比值，这表明NRF2的激活能够有效促进自噬过程。此外，研究还发现，Aβ和IFN-γ诱导的炎症反应可能通过形成一个恶性循环来加剧AD的病理进程。具体而言，Aβ的积累会引发氧化应激，而氧化应激又会促进促炎性细胞因子的表达，进而导致小胶质细胞的持续激活和炎症反应的加剧。这一恶性循环可能成为AD进展的重要驱动因素，而NRF2的激活则可能通过阻断这一循环，从而减轻AD的病理负担。

在方法学方面，本研究采用了多种实验手段以确保结果的可靠性和全面性。首先，通过细胞培养和药物处理，研究团队建立了稳定的实验模型。HMC3细胞在标准培养条件下能够保持其小胶质细胞的特性，为后续实验提供了良好的基础。其次，通过qPCR技术，研究团队验证了NRF2激活后特定基因表达的变化。qPCR的高灵敏度和特异性使得研究人员能够准确地检测到NRF2靶基因的表达水平。最后，利用RNA-seq和ChIP-seq技术，研究团队对NRF2的调控网络进行了全面解析。RNA-seq能够提供全基因组范围内的转录组数据，从而揭示NRF2激活后整个基因表达谱的变化。而ChIP-seq则能够定位NRF2在基因组中的结合位点，进一步确认其直接调控的靶基因。

此外，研究团队还对CDDO-Im的药理学特性进行了详细分析。CDDO-Im不仅能够有效激活NRF2，还具有良好的生物相容性和较低的毒副作用，使其成为一种具有潜力的治疗药物。与其他CDDO衍生物相比，CDDO-Im的额外电荷亲和基团使其在激活NRF2方面表现出更强的效力。这一特性使得CDDO-Im成为研究NRF2功能的理想工具，同时也为开发针对AD的新型治疗策略提供了可能的方向。

本研究的成果不仅有助于深入理解NRF2在AD中的作用机制，还为未来的临床研究提供了重要的理论基础。NRF2的双重调控功能——抑制炎症并促进自噬——表明其可能在AD的治疗中具有广泛的应用前景。通过调控NRF2的表达或激活其功能，有望开发出新的药物，以减轻AD患者的神经炎症反应并改善其认知功能。此外，本研究还强调了小胶质细胞在AD中的关键作用，提示针对小胶质细胞的干预可能成为治疗AD的新策略。

在实验设计和数据分析方面，研究团队采用了严谨的科学方法，以确保研究结果的准确性和可重复性。例如，在进行RNA-seq和ChIP-seq分析时，研究团队采用了高质量的实验技术和数据分析流程，以减少实验误差并提高结果的可信度。此外，研究团队还结合了公共的单细胞转录组数据，以进一步验证其发现的普遍性。这种跨实验和跨数据集的分析方法不仅增强了研究的说服力，也为未来的相关研究提供了参考。

总体而言，本研究通过系统地分析NRF2在小胶质细胞中的调控机制，揭示了NRF2在AD中的双重作用。一方面，NRF2能够通过抑制炎症相关基因的表达，减轻小胶质细胞的过度激活；另一方面，NRF2能够促进自噬相关基因的表达，从而增强细胞对异常蛋白的清除能力。这些发现不仅加深了我们对NRF2功能的理解，也为AD的治疗提供了新的思路和方向。未来的研究可以进一步探索NRF2在AD中的具体作用机制，并评估其在临床中的应用潜力。